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第一部分Orexin A对NPY神经元高电压激活钙通道的影响目的:食欲素(orexins,也称hypocretins)是近年发现的由后侧下丘脑(later hypothalamus area, LHA)合成和分泌的一种新的神经肽,它包括两个单体orexin A和orexin B,最初的实验结果显示脑室内注射orexin A能明显增加实验大鼠的摄食行为,后来发现它还参与睡眠与觉醒、能量代谢和内分泌等多种功能的调节,大量研究表明orexin A能使表达有OXR的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞的胞内钙增加,也能增加神经元的胞内钙,对细胞的很多功能具有调节作用。然而关于orexin A对电压依赖性钙通道(voltage-dependent calcium channels, VDCCs)特别是下丘脑神经元高电压激活钙通道(high voltage-activated calcium channels, HVAs)电生理特性的影响尚不清楚,本实验主要探讨orexin A对原代培养下丘脑NPY神经元HVAs的电流(IHVA)、通道的稳态激活和失活的影响。方法:首先运用免疫细胞化学的方法鉴定NPY神经元,然后结合形态学特征,采用全细胞膜片钳技术及记录IHVA后的再次鉴定比对,观察不同浓度的orexin A对IHVA的影响,并观察orexin A对IHVA的动力学特征的影响。结果:多数NPY神经元为梭形或三角形,其中又以梭形最多见;0.01~100 nM orexin A都能不同程度地增加IHVA,100 nM orexin A增加的幅度最大,EC50=0.75±0.09 nM;一般给予orexin A后30~60 s起效,2~3 min达到峰值;1 nM orexin A使IHVA的I-V曲线明显下移,稳态激活曲线左移即向膜电位更负的方向移动,而对稳态失活曲线则无明显影响。结论:orexin A增加IHVA且呈浓度依赖性和时间依赖性,并使通道更容易激活,而对通道的失活无明显影响。第二部分Orexin A影响NPY神经元高电压激活钙通道电流的机制目的:以往的研究证实Orexins主要是通过活化两个G蛋白耦联受体OX1R和OX2R发挥作用,且OX1R选择性与orexin A结合,先前的实验也表明orexin A增加NPY神经元的IHVA,本实验主要研究orexin A调节NPY神经元IHVA的机制。方法:首先利用全细胞膜片钳记录IHVA,然后给予1 nM orexin A,再分别给予10μM SB334867(orexin A受体拮抗剂)、U73122(PLC抑制剂)和GF109203X (PKC抑制剂),观察IHVA的变化情况;另外,也观察了预先给予10μM维拉帕米对IHVA的影响。结果:1 nM orexin A引起NPY神经元IHVA增加的效应分别被10μM SB334867、U73122和GF109203X明显抑制;预先给予10μM维拉帕米后,1 nM orexin A只能使IHVA幅度轻微增加。结论:orexin A主要通过与受体结合,再通过PLC/PKC-L型钙通道这一途径来增加IHVA的。