三螺旋β-(1→3)-D-葡聚糖是自然界中存在的具有特殊链结构的一类β葡聚糖,它不仅可以作为一种免疫反应修饰剂和调节剂,而且还显示较高的抗癌、抗肿瘤以及抗炎症等生物活性,因此日益引人注目。三螺旋β葡聚糖的生物活性与其在水中的溶解度、分子量、支化度以及化学结构息息相关,而且还强烈依赖于它的三螺旋构象。研究证明,三螺旋结构破坏以后,生物活性几乎消失。β-葡聚糖的三螺旋结构主要依靠分子内和分子间的氢键维持,在强碱、强极性溶剂或者高温条件下被破坏形成单链。反之,改变溶剂pH、极性或降低温度,β-葡聚糖单链能否通过氢键作用重组形成三螺旋结构?如何调控三螺旋结构的形态?三螺旋β-葡聚糖与蛋白质和DNA相似,具有独特的二级甚至三级结构。它作为生物大分子是否与蛋白质或DNA存在特殊的相互作用?因此,本论文旨在详细研究β-葡聚糖三螺旋结构的破坏(变性)和重组(复性),尤其系统研究它的复性过程及条件,阐明三螺旋结构的形成和形态变化的科学规律。同时,基于β-葡聚糖具有很强的形成螺旋结构的能力,研究它与生物大分子DNA之间的相互作用,并探索它们的生物功能和作用机制。本工作涉及高分子物理、生物化学和生物医学等交叉学科领域,是国际前沿研究领域之本论文的主要创新包括以下几点：(1)利用超灵敏DSC以及流变仪首次对三螺旋香菇β-葡聚糖的复性过程进行系统研究,提出一种简单、快速、准确确定多糖三螺旋构象的有效方法和手段,并揭示三螺旋结构形成和形态变化的科学规律；(2)基于氢键相互作用构建变性三螺旋香菇β-葡聚糖(s-LNT)与聚脱氧腺嘌呤核苷酸(poly(dA))的复合物(poly(dA)/s-LNT),探讨多糖浓度、复合作用时间、pH、温度以及外加化学试剂等因素对复合物形成的影响；(3)首次建立一种快速、灵敏、准确检测变性三螺旋β-葡聚糖与poly(dA)之间相互作用的方法,揭示poly(dA)和β-(1→3)-D-葡聚糖独特的选择性识别功能；(4)基于poly(dA)与s-LNT之间的相互作用,成功构建一种智能、高效、安全的基因转染体系,用于免疫治疗；(5)揭示poly(dA)序列长度影响复合物体系基因转染效率的科学规律,并初步证明巨噬细胞RAW264.7对香菇β-葡聚糖基因载体的摄取主要依靠液相内吞的方式,而不是通过常见的β-葡聚糖受体介导完成。本论文主要研究内容和结论概括如下。利用超灵敏DSC、圆二色谱、流变仪以及粘度法,对三螺旋香菇β-葡聚糖(t-LNT)的构象以及变性三螺旋香菇β-葡聚糖(s-LNT)的复性过程进行系统研究。实验结果表明,带支链的三螺旋β-葡聚糖水溶液的DSC和流变曲线在低温区(低于室温)分别出现三螺旋结构低温区构象转变特征温度(T1)。由此揭示,与传统的高分子溶液理论和方法相比,DSC和流变法是简单、快速表征β葡聚糖三螺旋构象的有效方法。同时,揭示s-LNT在复性过程中呈现多重构象变化,包括完整的三螺旋、含双链片段的缺陷三螺旋以及单链结构,它们显著依赖于复性时间、溶剂组成、分子量以及复性方式。把s-LNT/DMSO加入大量水使DMSO体积含量为5%时,复性香菇葡聚糖(r-LNT)在4小时内在～10℃(T1)出现低温区构象转变吸热峰,证明三螺旋结构快速复性行为的发生。在～43℃(T2)出现的新吸热峰归结于复性三螺旋结构中的双螺旋片段。当DMSO含量为50%时,复性多糖以三螺旋和单链构象共存。在复性过程中,调控三螺旋结构形成的关键因素是水与DMSO交换速度,交换速度越慢,越有利于形成完整的三螺旋结构。利用圆二色谱、紫外吸收光谱、动态光散射以及微量热法等手段对s-LNT与poly(dA)的相互作用进行系统研究,探讨多糖浓度、复合作用时间、pH、温度以及外加化学试剂等因素对复合物形成的影响。实验结果表明,s-LNT与poly(dA)通过氢键相互作用形成具有三螺旋棒状结构的复合物,二者在较短时间内快速结合,1小时后在～265nm处即可观察到一微弱负峰；在3-7h内达到平衡,且二者相互作用强烈依赖于s-LNT的浓度以及溶液的pH值。随多糖浓度增加,二者相互作用增强,当浓度达到60μg/ml时,相互作用到达最强。多糖浓度继续增加,相互作用逐渐减弱。复合物在pH5.5～11.5之间稳定存在,且pH7-10是最适宜的复合条件。同时,与裸poly(dA)相比,poly(dA)/s-LNT复合物显示较高的热稳定性,直至65℃才逐渐解离。基于荧光共振能量转移(FRET)和荧光各向异性(FA),以氧化石墨烯(GO)为平台,建立一种高灵敏、快速检测DNA与三螺旋β葡聚糖单链相互作用的方法,同时研究二者与GO之间的相互作用。以亚酰胺荧光素(FAM)标记的poly(dA)作为分子探针,通过π-π非共价键作用吸附在GO表面形成荧光猝灭体系。当s-LNT加入后,poly(dA)与s-LNT相互作用形成刚性的三螺旋复合物,导致复合物远离GO表面,促使溶液荧光恢复；三螺旋凝胶多糖单链(s-CUR)加入后,poly(dA)与s-CUR相互作用形成的复合物通过疏水作用仍然吸附在GO表面,导致较弱的荧光恢复；当t-LNT加入后,t-LNT与GO具有更强的相互作用,通过空间排挤导致poly(dA)远离GO表面,促使溶液荧光较强恢复。同时,FA结果表明,s-LNT与poly(dA)在极短的时间内即可观察到显著的荧光各向异性值增加,并在200秒内达到稳定,显示比圆二色谱(1小时内只观察到CD谱微弱变化,3小时后才观察到CD谱的显著变化)更高的灵敏度。FRET和FA还证明,poly(dA)只与β-(1→3)-D-葡聚糖单链相互作用,而不能与黄原胶、直链淀粉和普鲁兰等多糖链作用；同时,β-(1→3)-D-葡聚糖只与poly(dA)作用而与poly(dC)不发生相互作用,揭示poly(dA)和β-(1→3)-D-葡聚糖具有独特的选择性识别功能。基于s-LNT与poly(dA)的独特相互作用构建了一种新颖和安全的基因载体。将目标DNA与poly(dA)50通过二硫键结合形成DNA-SS-poly(dA)50序列,琼脂糖凝胶电泳和圆二色谱结果表明,s-LNT与DNA-SS-poly(dA)50序列中的poly(dA)50片段通过氢键相互作用形成复合物DNA-SS-poly(dA)50/s-LNT,且复合物中的二硫键在还原剂GSH或DTT作用下发生断裂。共聚焦显微镜和流式细胞术结果表明,s-LNT将DNA-SS-poly(dA)5o转染进入细胞,且转染效率显著依赖于s-LNT的分子量和浓度；分子量为7.0×104的s-LNT构建的基因转染体系显示最高的转染效率；基因转染不仅能在免疫细胞中进行,而且能在肿瘤细胞中进行。酶联免疫吸附法结果表明,适当分子量的s-LNT将靶向CpG DNA成功转染进入免疫细胞,并促使免疫细胞分泌大量免疫因子IL-12p40,进一步证明香菇β葡聚糖作为一种无毒基因载体的可行性及其潜在的应用价值。利用圆二色谱、琼脂糖凝胶色谱、流式细胞术以及酶联免疫等方法研究poly(dA)序列长度对复合物poly(dA)/s-LNT的稳定性及其转染效率的影响。实验结果表明,poly(dA)n/s-LNT复合物的稳定性和转染效率依赖于poly(dA)碱基的长度,序列长度越短,poly(dA)与s-LNT相互作用越弱,复合物稳定性越低；较长的分子链有利于复合物的稳定,也易于实现目标基因的高效转染表达。同时,利用荧光标记的受体抗体,包括PE标记的抗dectin-1抗体、FITC标记的抗TLR-2抗体、PE标记的抗CDllb抗体,以及FITC标记的抗CD18b抗体对RAW264.7细胞表面常见的β葡聚糖受体表达进行考察,并通过受体封闭实验,对多糖复合物载体的细胞摄取机制进行初步探索,揭示该基因载体在细胞中的摄取可能主要通过液相内吞的方式,而不是由常见的β葡聚糖受体(dectin-1、TLR-2和CR3)等介导完成。上述基础研究成果揭示了香菇β葡聚糖三螺旋结构形成的科学规律,证明β葡聚糖单链具有很强的形成螺旋结构的能力,对具有特殊序列结构的DNA,如poly(dA),显示特异性识别功能；同时,基于β葡聚糖与poly(dA)的特殊相互作用,构建一种新型的基因载体,可用于基因治疗。本工作为研究三螺旋香菇β葡聚糖的生物活性与构象之间的构效关系,以及揭示三螺旋结构在生命科学和医药领域的应用提供了科学依据,具有重要学术价值和应用前景。