1.尿路感染生物被膜细菌临床分布及耐药特性的研究研究背景生物被膜是指细菌附着于惰性物体如生物医学材料或机体黏膜表面后,繁殖、分化,并分泌一些多糖基质将菌体群落包裹其中克隆聚集缠绕形成的细菌聚集体膜状物。由于细菌生物被膜的存在,使被膜内的细菌能够逃逸抗生素的杀伤作用和机体免疫系统的清除,成为潜在的感染源,从而造成感染的反复发作。细菌生物被膜的耐药机制完全不同于浮游菌,在医院感染中发挥了重要作用。因此,本课题通过尿路感染相关生物被膜菌的研究,了解其临床分布和耐药特性,以便更好的指导临床用药。实验目的筛选尿路感染生物被膜菌,了解其临床分布,通过生物被膜菌与浮游菌耐药差异性分析,探讨细菌生物被膜对抗生素的耐药特性,初探生物被膜菌在体内较“真实”的耐药性。实验方法和结果(1)尿路感染生物被膜菌的筛选鉴定及临床分布:收集湘雅三医院2007年10月～2008年6月120例导尿管相关尿路感染(UTIs)患者导尿管和尿液标本,筛选鉴定生物被膜菌株和相应浮游株,对生物被膜半定量检测,了解尿路感染生物被膜细菌的临床分布。(2)临床耐药差异性分析:药敏实验分析生物被膜菌株和相应浮游菌在普通MH培养基上耐药性差异以及生物被膜阳性菌在泊洛沙姆(Poloxamer,F-127)培养基和普通MH培养基上耐药差异性分析。结果:(1)湘雅三医院120例UTIs患者导尿管中筛选出生物被膜菌48株,阳性率为40%。以革兰阳性的葡萄球菌属(43.75%)和肠球菌属(31.25%)占多数。而革兰阴性菌只占生物被膜菌的25%,包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌。(2)生物被膜菌与相应的浮游菌在普通MH培养基上药敏结果相似,无显著性差异(P＞0.05);生物被膜菌在Poloxamer培养基和MH培养基上药敏结果有显著性差异(P＜0.05)且前者耐药性更强。结论本院尿路感染生物被膜菌在临床上以葡萄球菌属和肠球菌属为主;生物被膜菌与浮游菌在体外耐药性分析未见明显差异,推测Poloxamer培养基有可能表现生物被膜菌较真实的对药物的耐受情况,其耐受性更强。2.粪肠球菌相关基因,QS调节系统与生物被膜形成三者相关性研究研究背景粪肠球菌现已上升为医院内感染病原体的第三位,易形成生物被膜。研究肠球菌相关基因与它生物被膜形成的关系,密度感应系统(Quorum sensing,QS)对这些基因的调控作用,进而如何影响生物被膜形成,对寻找出QS系统对肠球菌生物被膜调控的传导通路,深入确定可行的药物靶点和小分子物质,以达到抑制生物被膜形成,为解决实际临床难题都具有很大的指导意义。研究目的以粪肠球菌为研究对象,探讨粪肠球菌相关基因(表面蛋白—Esp、明胶酶编码基因—gelE、菌毛操纵子ebpA),毒力调控器—fsr系统与肠球菌生物被膜形成的相关性;初探实验室体外诱导与体内形成生物被膜基因表达的差异。为研究QS系统调控肠球菌生物被膜的传导通路,抑制生物被膜形成提供理论依据。实验方法和结果(1)逆转录PCR与实时荧光定量PCR方法对生物被膜和浮游菌组细菌esp、ebpA、gelE、fsrB四种与生物被膜形成相关的基因其表达进行检测。(2)实验室诱导粪肠球菌生物被膜形成,实时荧光定量PCR方法检测上述基因诱导前后表达差异,分析粪肠球菌实验室诱导和临床体内形成的生物被膜基因表达差异。结果:(1)esp,ebpA,gelE,fsrB基因与粪肠球生物被膜菌形成密切相关。生物被膜菌组esp,ebpA表达量分别是浮游菌组的298.2与59倍,表明esp,ebpA能促进生物被膜形成,生物被膜菌组gelE,fsrB表达量分别是浮游菌组的1/243.9与1/249,说明gelE,fsrB能抑制生物被膜形成。(2)在生物被膜形成过程中,fsr系统能调节gelE基因的表达,使gelE表达增加。提示也能调节esp,ebpA基因的表达,使esp,ebpA表达减少。(3)实验室体外诱导与体内形成的生物被膜在esp,ebpA,gelE,fsrB基因表达差异相似,但变化幅度明显比体内形成的小。说明目前的实验室模拟条件尚还不能完全体现复杂的生物被膜形成外环境。结论:esp,ebpA,gelE,fsrB基因与粪肠球生物被膜菌形成密切相关。esp,ebpA能促进生物被膜形成,gelE,fsrB能抑制生物被膜形成。提示fsr系统能调节esp,ebpA,gelE基因的表达,使esp,ebpA表达减少,gelE表达增加。目前实验室模拟条件还不能完全体现生物被膜体内形成的外环境。