BSE俗称疯牛病,1986年在英国首次发现,病原体是一种缺少核酸的蛋白颗粒,称为朊毒体(Prion),是神经等细胞表面一种正常蛋白PrPC的异构体PrPSc,近年来越来越多的证据支持BSE是人类nvCJD的病因,引起了全世界公众对疯牛病的恐慌。一个国家或地区的BSE风险状况、发病情况和监测系统的全面程度,已成为牛和牛产品进出口贸易中一项重要指标,其中监测系统的有效性,关键取决于检测手段的可靠性,而免疫组化诊断方法是BSE诊断的金标准。在本研究中,首先克隆、表达、纯化了羊、牛、人的PRNP基因,以纯化的重组PrP蛋白免疫PrPo/0小鼠,成功研制出系列PrP单抗,并对单抗的免疫学反应特性进行了详细的研究。随后,以自主研制的PrP单抗为核心试剂,成功建立了BSE免疫组化诊断方法,颁布为国家标准《牛海绵状脑病诊断技术》(GB/T19180-2003),开发的试剂盒获得了国家新兽药证书。该方法已用于我国BSE的实验室监测工作,至2006年底,共检测了全国各地14014份牛脑样品,结果全部为阴性,与国际标准单抗6H4的检测符合率为100%,为我国的“无疯牛病国际认证工作”积累了重要的试验数据。最后,以PrP单抗为分子探针,在国际上最为详尽地揭示了痒病小鼠适应毒株RML的株系特征,包括PrPSc的糖基化模式、脑部的病理学特征、PrPSc的沉积特点等。1羊、牛及人PrP基因的克隆及表达根据Gene Bank中PrP基因序列设计引物,以羊、牛及人血液中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增出PrP基因并进行序列测定。同源性分析表明：推导的氨基酸序列,羊与牛的同源性为96.2%,羊与人的同源性为93.8%,牛与人的同源性为94.3%,羊、牛及人PrP的8肽重复区均为5个。将牛的PrP 25～233aa基因、羊PrP 77～226aa基因、羊PrP91～226aa基因、人PrP 91～230aa基因克隆至原核表达载体pET32a,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,His·Bind(?) Kits纯化表达产物。SDS-PAGE电泳显示：表达产物的分子量大小与预计相符；免疫印迹试验证实：牛PrP 25～233aa基因、羊PrP 77～226aa基因、羊PrP 94～226aa基因、人PrP 94～230aa基因获得了正确表达,具有良好的抗原性。2 PrP单抗的研制及其免疫学反应特性的研究随着BSE全球蔓延趋势的加剧,我国迫切需要建立BSE免疫学检测方法,具有相关免疫学反应特性的PrP单抗是检测的核心试剂。笔者以纯化的重组PrP蛋白免疫Prpo/0小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,间接ELISA试验筛选出9株可持续分泌特异性PrP抗体的杂交瘤细胞4C11、7C11、4H10、13A4、9D11、11G8、8C10、13B11、1H2。随后,对上述PrP单抗的抗原表位及免疫学反应特性进行了系统的鉴定。以原核表达的牛/羊/人PrP、正常牛/羊的脑匀浆、BSE/羊痒病阳性的脑匀浆、BSE/羊痒病阳性的脑组织切片、痒病小鼠适应毒株RML及22L的脑匀浆为抗原,测定了9株单抗的ELISA、免疫印迹、免疫组化反应特性。结果显示：单抗4C11、1H2、8C10、13A4、13811可用于BSE/羊痒病的ELISA、免疫印迹检测；单抗4C11、8C10、13811可用于BSE/羊痒病的免疫组化检测。单抗1H2、13A4在免疫印迹及免疫组化试验中可识别痒病小鼠适应毒株RML及22L。单抗7C11在免疫印迹试验中只与羊痒病PrP27-30反应,结合其抗原表位77-93aa,证实了BSE与Scrapie的PrPSc PK消化位点存在差异；单抗4H10的抗原表位推测是羊痒病PrP27-30特异性的。3单抗介导BSE免疫组化检测方法的建立及其应用在免疫组化试验中,PrP单抗4C11可特异性识别BSE、羊痒病标准阳性脑组织样品上PrPSc核心片段,并与国际标准PrP单抗6H4具有相同的染色模式。用作核心试剂,建立了单抗介导BSE免疫组化诊断方法并标准化,现已颁布成为中华人民共和国国家标准《牛海绵状脑病诊断技术》(GB/T19180-2003),研发的BSE免疫组化诊断试剂获得国家新兽药证书。该方法应用于中国BSE的实验室持续监测工作,至2006年底,共检测了全国各地采集的14,014份牛脑样品,结果全为阴性,每批次所设立的阳性对照样品检测结果均呈阳性,与6H4检测结果的符合率为100%,为我国“无疯牛病国际认证工作”积累了重要的试验数据。4痒病小鼠适应毒株RML的株系特征研究痒病小鼠适应毒株RML感染的N2a细胞(Sc-N2a),经连续传代后仍能稳定增殖Prpres,建立了感染痒病的细胞模型。以Sc-N2a细胞裂解物为接种体,脑内接种C57BL/6J小鼠,经200±28天的潜伏期后,接种的C57BL/6J小鼠全部发病死亡,临床症状均表现为特征性的“共济失调”,而对照组,接种N2a细胞裂解物的C57BL/6J小鼠以及接种Sc-N2a细胞裂解物的PrP基因敲除小鼠均正常存活,获得了痒病感染的小鼠模型。随后,PrP单抗作为分子探针,对痒病小鼠适应毒株RML的株系特征进行了详尽的研究。Sc-N2a细胞增殖的PrPsc与发病小鼠脑组织中PrPsc的免疫印迹图谱展示了相同的糖基化模式,三种糖基化形式的PrPsc具相同迁移率(分子量大小一致),而且均是以单糖基化形式为主。发病小鼠的病理学研究结果显示：脑部的海绵状空泡主要分布于脑干、大脑、小脑、丘脑；脑、脾脏、回肠末端检测到PrPSc,脑部的PrPsc主要分布于大脑皮质、海马、丘脑,四迭体、小脑、嗅球有少量的分布。综上：1、成功克隆了羊、牛、人的PrP基因。同源性分析表明：推导的氨基酸序列,羊与牛的同源性为96.2%,羊与人的同源性为93.8%,牛与人的同源性为94.3%,羊、牛及人PrP的8肽重复区均为5个。2、获得了纯化的重组牛PrP 25～233aa、羊PrP 77～226aa、羊PrP 94～226aa、人PrP 94～230aa,具有良好的抗原性。3、研制出9株PrP单抗,并明确了其抗原表位及免疫学反应特性,为下一步BSE及羊痒病的免疫学诊断方法的研制打下了坚实的基础。拿到针对PrP 77～93aa抗原表位的单抗7C11,该表位处于BSE与羊痒病PrPsc的PK消化位点的差异部位；单抗4H10的抗原表位推测是羊痒病PrP27-30特异性的；国内外尚未见有同类单抗的报道。4、建立了单抗介导BSE免疫组化诊断方法(BSE诊断的金标准),实现了我国BSE检测技术的跨越性发展,现已颁布成为国家标准《牛海绵状脑病诊断技术》(GB/T19180-2003),用于我国BSE的实验室监测工作。研发的BSE免疫组化诊断试剂于2006年获得《国家新兽药证书》。5、成功建立了感染痒病的细胞模型及小鼠模型。以PrP单抗为特异性分子探针,在国际上最为详尽地揭示了痒病小鼠适应毒株RML的株系特征,包括PrPsc的糖基化模式、脑部的病理学特征、PrPsc的沉积特点等。