泽兰尾孢菌杀草毒素的初步研究

来源 :西南林学院 西南林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:H07081820607
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紫茎泽兰(EupatoriumadenophorumSpreng.)是目前世界上重要的恶性杂草之一。长期以来对该杂草的防治进行了大量的研究并已取得一定成果,但是现有的控制方法仍然没有完全阻止该杂草的扩展蔓延。研究获得有效的防治方法和新型除草剂仍然是该杂草研究关注的热点。 微生物及其代谢产物除草是目前新型除草剂研发的一个重点,本研究分离自然状态下紫茎泽兰叶片坏死组织中的微生物,以紫茎泽兰为模型,筛选出产毒微生物,获得对紫茎泽兰具有强致病力的产毒菌株。在此基础上探索该菌株的最适产毒条件,研究该菌株产生毒素的基本性质,并对毒素进行分离、纯化,为利用真菌毒素控制紫茎泽兰和新型生物源除草剂的研发奠定基础。主要研究结果如下: (1)紫茎泽兰叶片坏死组织相关微生物分离。本试验以云南省六个不同采集地的紫茎泽兰坏死组织为材料,分离得到98个微生物菌株。经初步鉴定分别为:尾孢菌Cercosporaspp.(35株),链格孢Alternariaspp.(18株),青霉Penicillinumspp.(5株),根霉Rhizopusspp.(8株),曲霉Aspergillusspp.(4株),细菌(8株),其它(20株)。显示尾孢菌是云南省紫茎泽兰叶片坏死组织的优势菌株。 (2)菌丝接种试验表明:编号为GM003、GM017、GM032、GM044、GM095、GM096、GM097、GM098的菌株能够使离体紫茎泽兰叶片针刺处产生典型的叶斑病病斑。通过对各病组织进行再次分离,均分离出原接种菌株,证明这8个菌株属紫茎泽兰的病原菌。 (3)代谢产物活性生物检测。用离体紫茎泽兰叶片作生测材料,采用针刺法对分离出的98个菌株发酵代谢产物进行活性筛选,发现有16个菌株(编号为GM003、GM017、GM032,GM044、GM053,GM059、GM063、GM070、GM076、GM079、GM083、GM086、GM095、GM096、GM097、GM098)能够产生对紫茎泽兰有伤害作用的毒素。通过伤害活性对比认为,GM017号菌株对离体紫茎泽兰叶片伤害作用最大,最具有研究和应用潜力。因此,本论文选用GM017号菌株作为杀草活性代谢产物研究的材料。通过对GM017号菌株培养性状和显微特征的观察描述、显微计测和绘图,查阅相关文献资料,并与郭光远等人对泽兰尾孢菌的描述对比,确定为泽兰尾孢菌(CercosporaeupatoriiPeck.)。 (4)用离体紫茎泽兰叶片作生测材料,对泽兰尾孢菌的产毒条件进行优化研究,结果表明:PD培养液最利于泽兰尾孢菌产毒。在PD培养液中加入寄主紫茎泽兰叶汁不能对毒素的产生和活性起促进作用,相反在一定程度上起抑制作用。泽兰尾孢菌在培养液初始pH值为中性的PD培养液中,采用自然昼夜交替的光照条件和全振荡的培养方式发酵8d产毒量最高。 (5)泽兰尾孢菌毒素粗提液的基本性质研究显示:毒素有较高的耐热性,经12l℃灭菌处理20min后,仍未出现失活现象;在改变毒素粗提液的pH后,泽兰尾孢菌毒素致病活性随着pH的增加而减小。该毒素能溶于甲醇、无水乙醇等极性强的有机溶剂,而不溶于乙酸乙酯、石油醚等极性弱有机溶剂,说明该毒素是一类极性较大的物质。 (6)泽兰尾孢菌毒素专化性研究表明:泽兰尾孢菌毒素对寄主植物(紫茎泽兰)有伤害作用,对几种常见的非寄主杂草也有不同程度的伤害作用,这说明该毒素是一种非寄主专化性毒素,具有广谱的除草能力。另外,紫茎泽兰幼叶对毒素反应快速、灵敏,且能产生典型的受害症状,是一种理想的生测材料。这些研究结果对于今后利用该毒素除草有一定指导意义。生测方法研究显示,与浸渍法、涂抹法相比,针刺法不仅反应速度快,而且用量少。 (7)采用系统溶剂法初步分离泽兰尾孢菌粗毒素,用生测活性最强的无水乙醇萃取物进行硅胶柱层析(氯仿.甲醇梯度洗脱),再结合重结晶的方法,得到对紫茎泽兰有强致病活性的无色晶体;该晶体熔程为104~C~107~C,易溶于甲醇、无水乙醇、丙酮,在乙酸乙酯、氯仿中溶解性差,仅溶解少许毒素晶体,在石油醚中溶解性极小;定性鉴定研究表明:排除该晶体属于糖及其甙类、酚类、鞣质、生物碱、皂甙、黄酮及其甙类、蒽醌及其甙类、甾体、萜类、氨基酸、多肽和蛋白质,属于有机酸类物质的可能性较大;紫外扫描发现,晶体在波长219nlTl左右有较强的吸收;以高效液相色谱(HPLC)对晶体纯度进行检验,214nm下在保留时间为20.95min出现了一个主要的吸收峰;进一步的质谱分析中发现,该物质质谱图比较混乱,推测毒素晶体不纯:用毛细管电泳分析晶体出现了两个峰,证明该晶体中含有两种物质,是混晶,需要进一步分离纯化。
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