随着基因工程技术的快速发展、蛋白质药物需求量的递增,各种蛋白药物表达平台相继面世,毕赤酵母作为一种最简单的真核表达系统越来越受到人们的重视。但野生酵母分泌的糖蛋白存在过甘露糖修饰的问题,存在较强的免疫原性,限制了该系统的发展和应用。本实验室前期已经成功敲除了毕赤酵母过度甘露糖修饰的相关基因,阻断了毕赤酵母的表达蛋白的高甘露糖基化,然后将复杂型糖基修饰的相关基因整合到毕赤酵母基因组上,获得能够合成哺乳动物复杂糖型的糖基工程酵母,成功用于蛋白质药物的表达制备。凝血酶(α-thrombin)是参与凝血过程中的重要蛋白酶,被广泛用于临床救治。丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase, BChe)可水解丁酰胆碱和可卡因,防止因神经递质积累而引起神经中毒,还能特异性地结合有机磷毒剂和农药,预防和治疗有机磷中毒。目前凝血酶和丁酰胆碱酯酶的主要来源,是从哺乳动物和人类的血制品中提取制备。但是这种生产方法受到环境和血源的制约,产量难以满足不了临床需求。糖基工程酵母兼具酵母的快速、高效表达和哺乳动物细胞的复杂型糖基修饰能力,本实验基于实验室构建的糖基工程酵母表达平台,表达重组人凝血酶原2和丁酰胆碱酯酶两种糖蛋白,探索糖基工程酵母在表达外源糖蛋白方面的应用前景。1.糖基工程酵母表达凝血酶原2的研究合成凝血酶原2的基因,构建至毕赤酵母表达载体中,转化筛选重组工程酵母菌,诱导表达培养,培养上清经SPFF和Unisp两步阳离子层析纯化,SDS-PAGE电泳图中得到37 kDa的目的条带。纯化样品经PNGaseF酶切处理,SDS-PAGE电泳图中去除糖链的蛋白分子量为35 kDa,与理论大小一致。肽图分析的结果进一步证明纯化得到的糖蛋白为凝血酶原2。2.毕赤酵母和哺乳动物细胞293T表达Ecarin的研究在体外,凝血酶原激活剂Ecarin可以将凝血酶原活化为凝血酶。为了得到活化的凝血酶,我们在毕赤酵母和293T细胞中开展了表达Ecarin的研究。全基因合成Ecarin序列,构建至毕赤酵母表达载体中,在毕赤酵母表达系统中,尝试了胞内表达和分泌表达的两种形式,均未获得有活性的Ecarin, Western Blot也未检测到特异性条带。哺乳动物293T细胞瞬时表达Ecarin,收集培养上清,加入293T细胞表达的Ecarin培养上清的凝血酶原2,将S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl)降解为pNA,产生淡黄色颜色反应；未加Ecarin培养上清的的凝血酶原2与S-2238没有颜色变化,表明哺乳动物293T细胞表达的Ecarin可以将糖基工程酵母表达的凝血酶原2活化为有活性的凝血酶。3.凝血酶原-2的活性研究利用发色底物吸光值的变化测Ecarin舌化凝血酶原2的剂量关系,发现当纯化的凝血酶原2的量不变时,随着293T表达Ecarin培养上清的增加,S-2238被降解产生的吸光值也相应的增加,说明Ecarin对prethrombin-2的活化具有剂量依赖性。纯化的凝血酶原2经Ecarin舌化后,可以促进小鼠血浆发生凝集,凝血时间为16s,以TT试剂盒中的凝血酶作为阳性对照,它与血浆反应的凝血时间为27s,说明凝血酶原2活化后具有血凝活性。4.野生型酵母表达不同形式的丁酰胆碱酯酶本实验利用糖基工程酵母表达制备重组人丁酰胆碱酯酶。在野生型酵母X33中表达不同结构的丁酰胆碱酯酶,比较不同结构的丁酰胆碱酯酶的表达量和活性差异,选取长效的丁酰胆碱酯酶用于糖基工程酵母的表达和酶活研究。全基因合成丁酰胆碱酯酶基因,构建毕赤酵母表达载体,并转化到野生型酵母X33中诱导表达培养,收集的培养上清经SDS-PAGE电泳分析,电泳图中观察不到目的蛋白条带。通过胆碱酯酶比色法测酶活,发现表达BChe勺培养上清可降解特异性底物碘化硫代丁酰胆碱(BSCh),与显色剂DTNB发生颜色反应,检测到吸光值变化。与稀释40倍的小鼠血清比较,只有后者酶活的80%左右,说明表达量较低。利用野生型酵母X33尝试表达丁酰胆碱酯酶单体的研究。天然的丁酰胆碱酯酶为同源四聚体,相对分子量为340 kDa,相对分子量较大,不利于酵母分泌表达,因此将构建丁酰胆碱酯酶单体表达载体。根据四聚体是通过丁酰胆碱酯酶碳端40个氨基酸相连,利用PCR技术构建C端截短型的丁酰胆碱酯酶(BCheC),将BCheC构建到到达载体中,野生型酵母X33表达BCheC的培养上清经SDS-PAGE电泳分析,电泳图中观察不到目的蛋白的表达。通过胆碱酯酶比色法分析,培养上清中有丁酰胆碱酯酶活性,但与稀释40倍的小鼠血清相比,活性较低。丁酰胆碱酯酶单体的半衰期远短于四聚体,为了延长其半衰期,将截短型的丁酰胆碱酯酶与HSA融合(BcheB-HSA),诱导串联表达,培养上清的SDS-PAGE电泳观察不到有目的蛋白的表达,通过胆碱酯酶比色法证明培养上清有丁酰胆碱酯酶的活性,但与稀释40倍的小鼠血清相比,活性较低。由于四聚体结构的丁酰胆碱酯酶最为稳定,通过向培养基添加多聚脯氨酸(poly-proline, polyP),能促进培养基中的单体和二聚体形成四聚体。考虑到polyP分子较小,容易降解,采用polyP融合HSA与BChe共表达得设计方案。将多聚脯氨酸-白蛋白基因和丁酰胆碱酯酶基因装入同一表达载体,利用野生酵母X33诱导共表达培养,培养上清的SDS-PAGE电泳图中观察不到目的蛋白的表达,胆碱酯酶比色法分析,培养上清中有丁酰胆碱酯酶活性,但与稀释40倍的小鼠血清相比,活性较低。5.融合白蛋白的丁酰胆碱酯酶在糖基工程酵母中的表达纯化由于HSA融合的截短型丁酰胆碱酯酶(BCheB-HSA)的蛋白分子量小于四聚体丁酰胆碱酯酶的蛋白分子量,半衰期长于单体丁酰胆碱酯酶(BCheC)。而且通过野生酵母X33的表达结果说明,BCheB-HSA的表达量和酶活与处于同一水平,因此选择BCheB-HSA基因转化到糖基工程酵母中表达和纯化,经过两步阳离子层析纯化,SDS-PAGE可观察到目的条带,Western Blot表明纯化得到目的蛋白,但目的蛋白已发生降解。胆碱酯酶比色法测酶活表明,纯化后的样品酶活性约为小鼠血清的四分之一,而且随着样品的稀释,吸光值也随之下低,表现出明显的剂量依赖性。X33表达BCheB-HSA的培养上清经同样的两步阳离子层析纯化后,Western Blot检测纯化样品中含有HSA,无BCheB-HSA融合蛋白。本实验基于糖基工程酵母表达外源糖蛋白-凝血酶原2和丁酰胆碱酯酶,纯化并经酶活分析,证明糖基工程酵母可表达具有活性的外源糖蛋白。