一、研究背景甲型流感病毒（IAV）是常见的呼吸道病原体,可通过飞沫或接触传播,具有较高的传染性。IAV易发生抗原漂移和抗原转化,从而引起季节性大流行。IAV合并细菌感染能引起严重肺炎甚至死亡。随着世界范围内抗生素的使用增加,耐甲氧新林金黄色葡萄球菌（MRSA）在社区和临床上检出的比例越来越高,且MRSA呈现广泛的耐药性,对各类抗生素均产生不同程度的耐药,只对万古霉素敏感,使得IAV-MRSA引起的共感染成为流感患者严重肺炎和死亡的主要原因。研究IAV-MRSA共感染肺炎的发病机制对于临床救治至关重要。近年来,研究者们在IAV与宿主免疫互作、IAV与MRSA的毒力和侵袭性、宿主组织的免疫耐受等方面开展了大量研究。随着测序技术和生物信息学的发展,宿主菌群对宿主生理、代谢调节和免疫功能以及复杂的宿主行为的影响受到越来越多的重视,研究者发现IAV感染造成的宿主菌群紊乱与IAV-细菌共感染肺炎的严重程度密切相关,益生菌干预可以提高宿主肠道或呼吸道Ig A含量,通过结合病原菌、加强共生菌的定植力,调节细菌代谢等方法抵抗外来病原入侵。但目前研究主要集中在肠道菌群上,缺少对呼吸道菌群的研究,对菌群中发挥作用的关键细菌及其对宿主保护作用机制知之甚少。本研究通过分析IAV-MRSA共感染小鼠肺炎模型的菌群特征,筛选出关键细菌,并初步探究关键细菌干预对IAV-MRSA共感染肺炎的治疗作用及对Ig A免疫应答的影响,为发展针对IAV合并细菌共感染肺炎的益生菌疗法提供参考。二、研究目的（1）分析IAV-MRSA共感染小鼠的呼吸道菌群,免疫应答和血浆代谢谱特征,探索与IAV-MRSA共感染相关的宿主关键细菌。（2）验证关键细菌对IAV-MRSA共感染小鼠的治疗作用并初步探究相关作用机制。三、研究方法（1）通过同时感染IAV（A/Puerto Rico/8/34株）和MRSA,构建IAV-MRSA共感染肺炎小鼠非致死模型,使用实时荧光定量PCR检测感染后第4天（4 dpi）和第13天（13 dpi）小鼠鼻和肺灌洗液IAV和MRSA的病原载量,使用HE染色评估4 dpi时肺组织的病理损伤;通过全长16Sr RNA基因三代纳米孔测序明确4 dpi和13 dpi时小鼠鼻和肺灌洗液的菌群特征;使用流式细胞术和ELISA方法检测4dpi时肺组织肥大细胞、巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞、B细胞、调节性T（Treg）细胞、γδT细胞、CD4+/CD8+T细胞、趋化因子配体2（CCL-2）、白细胞介素-6,8,9（IL-6,IL-8和IL-9）、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的变化,检测脾脏B细胞和CD4+/CD8+T细胞水平;使用液相色谱-质谱联用技术检测4 dpi时小鼠血浆代谢产物变化;最后通过下呼吸道菌群、免疫细胞和血浆代谢产物的相关性分析,筛选与共感染小鼠的免疫应答和代谢紊乱密切相关的关键细菌。（2）采用全长16Sr RNA基因三代纳米孔测序,检测IAV感染4天后小鼠鼻咽、口咽、肺灌洗液和粪便的菌群特征,分析并比较不同部位菌群的相关性,进一步明确关键细菌在正常和IAV感染小鼠的各个采样部位点的分布情况。（3）通过先接种IAV病毒,4天再后接种MRSA,构建IAV-MRSA共感染肺炎小鼠致死模型。基于前述关键细菌对IAV感染的应答情况,在IAV感染后,MRSA感染前的4天内,通过滴鼻加饮水方式,对IAV-MRSA共感染肺炎小鼠致死模型进行干预。观察小鼠死亡率,采用实时荧光定量PCR检测IAV-MRSA共感染3天后小鼠肺灌洗液中IAV和MRSA的病原载量,采用HE染色检测小鼠肺组织的病理损伤,评估关键细菌对IAV-MRSA共感染小鼠的干预情况。为了研究关键细菌干预的相关机制,进一步使用实时荧光定量PCR,检测关键细菌干预后,MRSA感染前小鼠肺灌洗液中IAV的病原载量;并检测此时小鼠肺灌洗液与粪便的菌群的分布特征,结合流式细胞术和ELISA方法,检测小鼠肺灌洗液中分泌型Ig A、H1N1反应性Ig A、血清微生物反应性Ig A、肺组织Ig A+细胞、Ig A+浆细胞、Treg细胞、辅助性T细胞17（Th17）、白细胞介素-21（IL-21）、肿瘤坏死因子β（TNF-β）、B细胞活化因子（BAFF）、增殖诱导配体（APRIL）水平,评估关键细菌对小鼠T细胞依赖性（TD）Ig A应答和T细胞非依赖性（TI）Ig A应答的影响。通过混合抗生素饮水两周构建小鼠肠道菌群耗竭模型,使用流式细胞术和ELISA方法检测小鼠肺灌洗液中分泌型Ig A、微生物反应性Ig A、肺组织Ig A+细胞与Ig A+浆细胞水平、Treg细胞、Th17细胞、IL-21、TNF-β、BAFF和APRIL水平评估肠道菌群对小鼠TD-Ig A应答和TI-Ig A应答的影响。三、研究结果（1）成功构建了IAV-MRSA共感染肺炎小鼠非致死模型,发现IAV-MRSA共感染导致小鼠4 dpi时体重显著降低（P＜0.001）,肺组织损伤、病理评分显著升高（P＜0.05）;IAV-MRSA共感染小鼠肺灌洗液中IAV（P＜0.001）和MRSA病原（P＜0.001）载量较IAV或MRSA单独感染小鼠显著升高,且在13 dpi时仍可检出低水平的IAV和MRSA病原。全长16Sr RNA基因测序结果表明,IAV-MRSA共感染引起小鼠鼻和肺灌洗液菌群紊乱,发现肺灌洗液中鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）相对丰度在4 dpi（P＜0.01）和13 dpi（P＜0.05）时明显降低。在固有免疫方面,IAV-MRSA共感染小鼠同时具有MRSA和IAV单独感染的免疫特征,表现为肺巨噬细胞和NK细胞水平降低,γδT细胞水平增加,但未观察到统计学变化。在适应性免疫方面,IAV-MRSA共感染小鼠与IAV感染的免疫特征更为相似,表现为脾脏CD4+/CD8+T细胞和B细胞水平显著增加（P＜0.05）,肺组织细胞因子IL-9、IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-8水平显著升高（P＜0.05）。血浆代谢物的液相色谱-质谱联用检测结果表明,IAV-MRSA共感染和IAV单独感染小鼠的血浆代谢谱特征相似,而MRSA感染小鼠的血浆代谢谱和正常小鼠相似。其中,与正常小鼠比,共感染小鼠的代表性差异代谢产物是甲戊内酯（上调）,而MRSA感染和IAV感染小鼠的代表性差异代谢产物是酪氨酰谷氨酰胺（上调）和溶血磷脂胆碱（下调）。基于下呼吸道菌群、宿主免疫细胞和血浆代谢产物的相关性分析发现,鼠乳杆菌的相对丰度与肺巨噬细胞和肺NK细胞水平呈正相关,与脾B细胞和CD4+/CD8+T细胞水平呈负相关,与多种血浆代谢产物水平强相关,可能是缓解IAV-MRSA共感染肺炎的关键细菌。（2）鼠乳杆菌在正常小鼠的口咽（23%）、鼻咽（12%）、肺灌洗液（22%）与肠道（22%）中都占据优势地位,而IAV感染改变了呼吸道微生物群落的组成,使鼠乳杆菌在鼻咽（1%）和肺灌洗液（10%）中的相对丰度降低,口咽（6%）和肠道（2%）中的相对丰度下显著降低（P＜0.05）。此外,正常小鼠的肺部菌群与鼻咽菌群的相似程度高于口咽菌群,而IAV感染增加了肺和鼻咽菌群之间的相似性,并降低了肺与口咽微生物群之间的相似性,结果表明,IAV感染增加了鼻咽微生物群对肺部微生物群的影响,可能使病原更易从鼻咽到达肺部。（3）通过IAV感染4天后再感染MRSA,进一步构建了IAV-MRSA共感染肺炎小鼠致死模型,模型在7天内的死亡率为100%。针对鼠乳杆菌在IAV-MRSA共感染肺炎可能发挥的作用,我们在小鼠感染IAV后采用滴鼻加饮水的方式进行鼠乳杆菌干预,并在继发MRSA感染时停止。结果发现,鼠乳杆菌干预显著降低了IAV-MRSA共感染肺炎致死模型的死亡率（P＜0.01）和肺灌洗液中IAV（P＜0.001）与MRSA病原（P＜0.01）载量。菌群分析则表明,鼠乳杆菌干预增加了肠道鼠乳杆菌绝对丰度,能一定程度上恢复IAV造成的肠道菌群紊乱,但对肺部菌群无显著影响。结合流式细胞术和ELISA检测发现,鼠乳杆菌干预后小鼠的肺灌洗液分泌型Ig A、血清微生物反应性Ig A、肺组织Ig A+浆细胞水平（P＜0.01）和APRIL含量（P＜0.001）显著增加,但肺组织Treg细胞、Th17细胞、IL-21和TNF-β水平无显著变化。我们推测,鼠乳杆菌可能通过加强TI-Ig A应答进而降低共感染小鼠的死亡率。为了进一步验证肠道菌群在鼠乳杆菌调节小鼠Ig A水平中的作用,我们采用了抗生素饮水方法,成功构建了肠道微生物耗竭小鼠模型,发现菌群耗竭小鼠的肺组织中APRIL水平显著降低（P＜0.01）,可能通过抑制TI-Ig A应答,进而降低肺灌洗液总分泌型Ig A水平和血清微生物反应性Ig A的含量。三、研究结论首先,本研究构建了IAV-MRSA共感染肺炎非致死小鼠模型,结合流式细胞术,全长16Sr RNA三代测序技术和代谢组学,筛选得到与IAV-MRSA共感染小鼠的免疫应答和血浆代谢产物紧密相关的关键细菌-鼠乳杆菌。然后,我们发现鼠乳杆菌在正常小鼠的口咽、鼻咽、肺和肠道中占优势地位,而IAV感染使鼠乳杆菌在所有位置的相对丰度降低。最后,我们使用滴鼻加饮水的方法进行鼠乳杆菌干预,发现鼠乳杆菌可通过调节肠道菌群来增强T细胞非依赖型-Ig A应答,进而提高小鼠肺灌洗液和血清中Ig A水平,以降低IAV-MRSA共感染肺炎小鼠致死模型死亡率。本研究不仅有助于更好地理解宿主微生物组在呼吸道感染中的作用,也为发展针对IAV细菌共感染肺炎的益生菌疗法提供了重要参考。