沃尔巴克氏体(Wolbachia)是一类革兰氏阴性细菌，广泛存在于多种节肢动物的生殖细胞或体细胞中，能够通过宿主卵细胞质传递给子代。最新的研究表明，除了在丝状线虫、陆生等足动物、蜘蛛目和蜱螨目中存在外，其在昆虫中的分布更为广泛，超过65％以上的昆虫种类中都发现有Wolbachia感染，包括直翅目、膜翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目和同翅目等。目前，Wolbachia的研究已成为国内外热点领域之一，主要原因是它能对宿主的生殖产生多种调节作用，包括雌性化、孤雌生殖、杀雄、精卵细胞质不亲和(CI)等，正是由于这些调节作用，使Wolbachia得以在宿主种群内成功传播。其中，CI是最为普遍的表型，即当Wolbachia感染的雄性宿主受精于未感染或感染了不同Wolbachia菌株的雌性宿主时，产生的后代由于发育缺陷在胚胎时期死亡。而感染相同Wolbachia菌株的雌性和雄性宿主在交配后则能产生正常发育并携带Wolbachia的后代。有关CI的分子机制直到现在仍未得到明确的解释。研究发现，在CI胚胎进行核分裂时，雄性原核出现染色质问桥，因此无法正常存活。　　 本研究首次对我国六个不同地区黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)体内Wolbachia的感染状况进行检测，发现湖北武汉、天津、云南六库地区的黑腹果蝇均被Wolbachia感染，而其它三个地区(海南尖峰岭、河南鸡公山、西藏下察隅)无感染现象。通过克隆得到它们的wsp基因序列，提交GenBank，注册号分别为：FJ403330，FJ403331，FJ403332。并对所得序列进行系统进化分析表明，感染这三个地区果蝇的Wolbachia品系之间亲缘关系十分相近，均属于A大组的Mel亚群。　　 Hira是一种组蛋白调节基因，其突变也能引起果蝇的雄性原核发育障碍，为了研究CI与Hira基因的关系，我们首先通过qRT-PCR的方法检测了不同感染状态下，宿主果蝇Hira基因的表达水平。结果发现，在Wolbachia感染能引起强CI表型(后代胚胎孵化率很低)的雄性果蝇中，Hira表达水平显著低于弱CI表型或未感染的雄果蝇。由于CI的强度随雄性宿主日龄的增加逐渐下降，通过分析1 d和5 d雄蝇中Hira的表达水平发现，5 d雄蝇中Hira的表达水平显著高于1 d的雄果蝇。此外，考虑到宿主果蝇幼虫发育时间与CI强度密切相关，幼虫发育期长的雄性果蝇引起的CI强度越低(后代胚胎孵化率升高)，通过比较感染wMelPop但幼虫发育时间不同的雄性果蝇中Hira基因的表达，发现随着幼虫发育期的延长，其体内Hira基因表达水平逐渐升高。幼虫发育速度最快的果蝇“兄长”引起的CI强度最高，但其体内Hira基因表达水平却最低。这些结果表明，Wolbachia感染引起雄性果蝇体内Hira基因表达下调可能是导致CI的原因之一。　　 为了探究这种现象是否只发生在果蝇这种单一宿主上，通过检测埃及伊蚊(传播登革热病毒的主要媒介昆虫)中Hira的表达，发现了与果蝇中类似的结果，即CI强度越高，引起CI的雄蚊体内Hira的表达量越低。为了进一步证明Wolbachia感染引起雄性宿主体内Hira基因表达下调是导致CI的原因，利用RNA干扰(RNAi)技术，将未感染雄蚊中的Hira基因敲降，模拟感染Wolbachia雄蚊的状况，然后将之与未感染雌蚊进行交配，结果产生了类似CI的表型，即导致子代胚胎孵化率下降，并且感染Wolbachia的雌蚊能够部分挽救这种由于雄蚊Hira基因敲降引起的缺陷。体外细胞学研究发现，一种与Hira基因具有明显互补序列的微小RNA(aae-miR-12)在感染和未感染Wolbachia的埃及伊蚊细胞中表达水平存在差异。与未感染的Aag2细胞相比，aae-miR-12在感染wMelPop-CLA的蚊子细胞中的表达水平上调，这种结果是与Hira基因表达情况截然相反，表明aae-miR-12可能与Wolbachia感染有关，并可能对Hira基因的表达起调控作用。为了进一步验证这一假说，我们将人工合成的aae-miR-12类似物和抑制物分别转染细胞，并检测细胞中Hira基因的表达情况，发现aae-miR-12对Hira基因表达具有明显抑制作用。当把aae-miR-12类似物转染到未感染Wolbachia的蚊子细胞后，细胞中Hira基因表达明显下调；然而，当把aae-miR-12抑制物转染入感染wMelPop-CLA的细胞时，Hira基因表达水平与对照相比显著上升。而利用体外构建pIZ/GFP-Hira载体，以GFP为报告基因的方法，发现aae-miR-12可以通过与Hira基因序列的互补配对来抑制其表达。因此，从以上结果推测，在埃及伊蚊中，Hira基因的表达可能受到一种微小RNA-aae-miR-12的负调控作用。Wolbachia感染可能通过上调aae-miR-12表达，抑制Hira基因表达，最终导致宿主CI的表型，这个结果将为研究Wolbachia与宿主相互关系提供一条新的思路。　　 为了全面探究Wolbachia感染引起CI的分子机制，通过microarray技术比较了感染和未感染Wolbachia的雄性果蝇三龄幼虫的精巢中差异表达的基因，结果发现，有296个基因表达量发生至少1.5倍以上的改变(q<0.05)，这些基因的功能涉及到新陈代谢、免疫、生殖等。其中，167个基因发生上调，129个基因发生下调。采用定量RT-PCR的方法进一步验证了部分基因，证明其表达改变模式与microarray的结果一致。有趣的是，Wolbachia感染导致与免疫相关的基因大部分出现上调，而与生殖相关的基因则多数下调。根据这些结果我们推测，Wolbachia可能一方面激活了宿主的免疫途径，另一方面却对其精子发生产生不利影响。具体基因功能正在进一步研究中。