研究背景糖尿病是一种严重危害人类健康的全球性疾病,其患病率逐年攀升。我国已成为仅次印度的第二大糖尿病国家。随着其病情的演变,将逐渐引起眼、肾、神经、心脏、血管等组织的慢性进行性改变。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是最常见的糖尿病微血管病变之一,其早期表现为微量尿蛋白,随着病情进展,将逐步衍变为弥漫性或结节性肾小球硬化,最终导致终末期肾功能衰竭。在西方发达国家,每年大约40%的糖尿病患者发展为DN。DN主要是由肾小球系膜细胞的过度增殖及其分泌的系膜基质蛋白、胶原纤维蛋白在系膜区堆积等一系列改变逐步演变而来。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidy linositol3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinases B,Akt)信号通路广泛存在于各种细胞,各种酪氨酸生长因子可与其相应的配体结合通过一系列反应激活PI3K, PI3K与AKT结合使AKT磷酸化进而激活AKT,磷酸化的AKT通过调控其下游周期蛋白的表达发挥调控细胞周期的作用。既往研究证实,高糖可以通过PI3K/AKT通路诱导肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, MC)过度增殖。因此,抑制PI3K/AKT通路可以抑制MC增殖,从而可以缓解DN的发生、发展。然而,近年来的很多研究发现P13K抑制剂的特异性不高,且毒副作用大,缺乏很好的临床实用性。因此,抑制AKT成为抑制PI3K/AKT通路的新方向。Tribbles同源蛋白3(tribbles homolog3, TRB3)是调节细胞有丝分裂的假性激酶蛋白。近年来研究发现TRB3可以通过抑制AKT的磷酸化抑制PI3K/AKT信号通路,从而发挥调控细胞周期、促进细胞凋亡的作用。这一通路在胰腺、肝脏、淋巴细胞、结肠癌等研究中均得到验证。而且,生理条件下TRB3在肾脏中有少量表达。因此,我们推测：促进TRB3的表达可能抑制PI3K/AKT通路进而抑制肾小球系膜细胞的增殖。近来的研究表明过氧化物酶增殖体激活受体(peroxisome proliferator activated receptor alpha, PPAR-α)可与TRB3基因启动子的-750至-350之间的序列结合,PPAR-α激动剂可以促进TRB3的表达抑制AKT的磷酸化,进而发挥促凋亡的作用。非诺贝特是人工合成的PPAR-α激动剂,在淋巴细胞、胰腺癌等的研究中已证实,非诺贝特可以通过以上机制促使细胞发生周期阻滞,促进细胞凋亡。大量研究证实,PPAR-α在肾小球系膜细胞中有少量表达。因此,我们推测：非诺贝特可以通过促进TRB3表达抑制AKT磷酸化,进而抑制肾小球系膜的增殖。肾小球系膜细胞增殖是在细胞周期蛋白的调控下严密进行的,其细胞周期按照各时相(G,-S-G2-M)严格有序进行。细胞能否进入M期以及能否顺利完成有丝分裂进行增殖,主要取决于能否顺利通过G1/S转换和G2/M转换。而细胞周期主要是通过磷酸化的AKT调控其下游周期蛋白的表达实现。然而,目前尚不明确非诺贝特能否通过促进TRB3的表达抑制AKT的磷酸化,进而下调其下游周期蛋白的表达,并使肾小球系膜细胞发生周期阻滞,最终抑制肾小球系膜细胞的增殖。因此,我们以肾小球系膜细胞为研究对象,探讨肾小球系膜细胞中TRB3的表达,明确非诺贝特能否通过促进TRB3的表达调控细胞周期进而抑制肾小球细胞的增殖,以期为非诺贝特防治DN的发生发展提供理论及临床依据。研究目的本课题拟在建立高糖诱导肾小球系膜细胞增殖为研究模型的基础上,通过观察非诺贝特对肾小球系膜细胞TRB3蛋白表达影响,并检测其对磷酸化的AKT的表达影响,探讨非诺贝特对高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖的影响及机制。研究方法1.非诺贝特药物的配置取360.84mg非诺贝特溶于10m1DMSO中配成100mmol/L母液。按照高糖DMEM:非诺贝特母液=9：1稀释非诺贝特,即可得100gmol/L非诺贝特,按1：1、1：9的比例稀释100B.mol/L非诺贝特即可得50、10μimol/L非诺贝特。2.肾小球系膜细胞的培养及分组取处于对数生长期的肾小球系膜细胞,按适当比列接种于6、24、96孔板,静置6小时贴壁后,换成含1%胎牛血清的低糖DMEM使其同步化处于G0期,将系膜细胞分为正常对照组(N,5.5mmol/L葡萄糖)、高糖组(H,25mmom/L葡萄糖)、高糖+不同浓度的非诺贝特(10μnol/L、50μmol/100μmol/L的非诺贝特)。3.CCK-8法测定细胞的活力：肾小球系膜细胞以1×104/ml接种至96孔板中,按上述分组处理后,培养24h, PBS洗一次每孔加入100μ L的DMEM和10μL CCK8试剂混匀,并设置无细胞但含有DMEM和CCK8的空白对照组。于450nm波长测吸光度以判断细胞活力。4. Hoechst33258染色和吖啶橙染色观察各组肾小球系膜细胞凋亡形态学改变：肾小球系膜细胞以1×105/ml接种至6孔板中,按上述分组处理,培养24小时后,PBS洗2次,用4%多聚甲醛固定,加入Hoechst33258、吖啶橙染色在荧光显微镜下观察非诺贝特对肾小球系膜细胞凋亡的影响5.流式细胞术检测非诺贝特作用后肾小球细胞的周期改变：肾小球系膜细胞以1×106/ml接种至6孔板中,按上述分组处理,培养24小时后,胰酶消化各组细胞,并收集细胞悬液离心,弃上清液,加入PBS液,调节细胞浓度至1×106/ml。重复洗两次后,加入70%乙醇固定过夜。离心,PBS洗两次后,加入RNA酶于37℃水浴30分钟,再加入碘化丙啶于4℃染色30分钟,上流式机检测样本,Cell Quest软件分析细胞周期变化。6.免疫细胞化学观察各组TRB3蛋白的表达及变化：肾小球系膜细胞以2×104/ml接种于放有盖玻片的24孔板内,按上述分组处理,培养24小时后,捞出盖玻片。多聚甲醛脱水固定30min, PBS洗3次；用3%H2O2-甲醇封闭内源性过氧化物酶10min, PBS洗3次,；0.3%Triton的PBS孵育10min, PBS洗3次；非免疫兔血清湿盒内封闭30min；吸弃多余血清,加TRB3抗体,4℃过夜；滴加二抗1001μL,37℃孵育30min, PBS洗涤3次,ABC法染色,DAB显色,苏木素复染,梯度酒精脱水,滴加封片剂封片。并在免疫荧光镜下观察TRB3表达情况。7. Western Blot技术检测非诺贝特对肾小球系膜细胞中TRB3、p-AKT表达影响：按上述分组处理细胞。收集总蛋白,BCA法测蛋白浓度,12%SDS-PAGE胶上电泳,100V、1h半干转膜仪转至PVDF上,5%脱脂牛奶封闭1h。洗膜后,加入TRB3多克隆抗体(1：500稀释)或者P-AKT单克隆抗体(1：500稀释)4℃过夜。洗膜后,二抗(1：2000稀释)孵育1h。加入化学发光剂ECL,暗室曝光,显影、定影后扫描,用ImageJ图像分析系统分析结果。蛋白的相对表达量为目的蛋白的灰度值与以GAPDH为内参进行半定量分析。以上实验重复3次。8.统计方法采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示,多组样本均数,先进行方差齐性分析,再采用OneWay-ANOVA进行方差分析,方差齐时两两比较采用LSD检验,方差不齐时用Welch校正后使用Dunnett’s T3检验,P<0.05表示差别具有统计学意义。研究结果1.不同浓度非诺贝特对肾小球系膜细胞增殖活力影响：高糖环境下培养24小时,肾小球系膜细胞OD值为(0.80±0.06),显著常高于正常对照组(0.58±0.05)(P±0.000),10.50.100μ mol/L非诺贝特各组的OD值分别为(0.67±0.02)、(0.56±0.02)、(0.44±0.03)显著低于高糖组(P=0.000),各组间差异有统计学意义(F=71.584,P=0.000)2.Hoechst33258染色和吖啶橙染色后荧光显微镜下观察：正常对照组肾小球系膜细胞染色的细胞核呈均匀淡蓝光或绿光,高糖组与正常对照组相比未见明显差异,非诺贝特组的细胞皱缩,细胞核致密浓染、染色质边集、可见核碎裂.3.流式细胞术检测细胞周期示：高糖组肾小球系膜细胞G0/Gl期比例为(71.81±0.92)%,显著低于正常对照组(85.72±0.35)％(P=0.000),10.50.100μmol/L非诺贝特各组GO/G1期比例分别为(78.78±4.12)%、(82.04±0.43)%、(84.71±0.21)%,显著高于高糖组(P均=0.000),各组间G0/G1期细胞比例差异有统计学意义(F=115.775,P=0.000)。4.免疫细胞化学荧光镜下观察：正常对照组、高糖组、非诺贝特组肾小球系膜细胞均有TRB3蛋白表达,其表达部位主要定位于细胞浆,正常对照组、高糖组胞浆染色呈浅黄-棕色,表达呈弱阳性。非诺贝特组呈棕色,表达呈强阳性,且随着非诺贝特浓度增加TRB3表达增强。5.Western-Blot技术显示高糖组TRB3蛋白相对灰度值为(0.34±0.03),与正常对照组(0.37±0.01)相比无明显差异(P=0568),10、50、100μ mol/L非诺贝特各组相对灰度值分别为(0.52±0.04)、(0.58±0.01)、(0.62±0.03),显著高于高糖组(P均=0.000)。高糖组p-AKT蛋白相对灰度值为(1.84±0.02),与正常对照组(1.39±0.04)相比表达量明显增多(P=0.000),10μmol/L非诺贝特p-AKT蛋白相对灰度值分别为(1.83±0.03),与高糖组相比无差异(P=0.079),50、100μmol/L非诺贝特p-AKT蛋白相对灰度值分别(1.58±0.03)、(1.45±0.04)显著低于高糖组(P均=0.000)研究结论非诺贝特可以抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖,使其发生G1/S期阻滞,诱导其发生凋亡。其机制可能是通过促进TRB3的表达抑制AKT的磷酸化,进而调其下游周期蛋白的表达,并使肾小球系膜细胞发生周期阻滞,最终抑制肾小球系膜细胞的增殖。