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背景:药物肝损伤(Drug-induced liver injury,DILI)是临床用药中一种常见的副作用。近年来,随着新药的不断出现,临床用药种类和联合用药方式的不断增加,DILI的发病率逐年升高。因此,如何快速和准确的评价药物肝毒性已成为目前新药研发中亟待解决的关键技术问题。在药物肝毒性的临床前评价方面,目前的方法大多存在检测时间滞后、特异性不高或不能在活体水平检测等缺点。因此,迫切需要建立一种准确的、高灵敏性、可动态连续地检测肝损伤的动物模型。氧化应激反应(Oxidative stress,OS)是指机体内显著增加活性氧(Reactive oxygen species,ROS)或活性氮(Reactive nitrogen species,RNS)等自由基,超过了机体内的抗氧化平衡后,影响正常功能的病理过程。在生理情况下,ROS/RNS由一些保护性的抗氧化机制降解,如果过量产生或者体内还原物质的缺乏,可以导致OS和进一步的病理损伤。其中在药物肝毒性方面,有报道表明有很多药物的肝损伤机制都与OS有关,在药物的肝损伤中起着重要的作用。因此,可以把OS作为药物肝损伤的一种指标,来检测药物肝损伤的发生。目前常用的在活体水平检测到肝损伤OS的方法是对给药后的动物取材后测量各种组织内指标,而没有一种方法可以直接在活体动物上检测OS。因此,建立一种可以在活体水平,实时、动态的检测药物肝损伤中OS的动物模型,对于研究药物肝损伤的机制过程有着重要的作用。Genevieve C 研究报道了 一种化学物质 Peroxy Caged Luciferin-1(PCL-1),PCL-1 可与自由基反应生成萤火虫素,萤火虫素在荧光素酶催化下可产生生物发光信号。利用PCL-1和生物发光系统能够在细胞水平检测到ROS和RNS,为检测活体内的氧化应激提供了一个新的思路。目的:应用生物发光活体成像系统和能够检测氧化应激的分子探针PCL-1,建立能够监测药物肝损伤时在肝内的氧化应激情况的可视化小鼠模型。方法:1.运用原料化学合成药物PCL-1。2.运用脂质体转染技术建立可稳定表达荧光素酶的细胞系。3.运用显微注射和胚胎移植的方法建立肝内特异性表达荧光素酶的小鼠。4.运用生物发光活体成像技术在细胞水平和活体肿瘤模型中验证PCL-1检测氧化应激的可行性。5.运用生物发光活体成像技术和PCL-1在活体小鼠上检测对乙酰氨基酚(APAP)和四氯化碳(CCl4)在肝内造成的氧化应激。6.运用常规病理、免疫组化、TUNEL技术检APAP和CCl4造成的肝损伤程度。结果:1.成功合成了化学药物PCL-1,成功建立了可稳定表达荧光素酶的细胞系HepG2-Luc,成功建立了肝内特异表达荧光素酶的小鼠系Alb-Luc。2.应用PCL-1和生物发光活体成像系统,我们在HepG2-Luc细胞水平我们观察到了外源加入H2O2引起的发光信号,也在活体肿瘤模型中观察到了外源加入H2O2引起的发光信号。3.应用PCL-1和生物发光活体成像系统,可以观察到APAP在HepG2-Luc细胞水平产生的氧化应激信号。在HCR乳鼠活体水平,我们观察到了 APAP在300mg/kg可产生明显的氧化应激信号。4.应用PCL-1和生物发光活体成像系统,我们观察到了 APAP在Alb-Luc小鼠活体水平引起的氧化应激信号,尤其在300mg/kg剂量有更强的信号,并且应用GSH作为保护剂可以减弱APAP引起的氧化应激信号。HE染色、免疫组化、TUNEL实验结果都显示APAP在300mg/kg能明显的造成小鼠的肝损伤,包括细胞坏死、蛋白硝基化、核DNA断裂。并且应用GSH作为保护药可以减少APAP引起肝损伤。5.应用PCL-1和生物发光活体成像系统,我们观察到了 CCl4在Alb-Luc小鼠活体水平引起的氧化应激信号,尤其在1ml/kg的剂量,有明显更强的信号。HE染色、免疫组化、TUNEL结果都显示CCl4在1ml/kg能明显的造成小鼠的肝损伤,包括细胞坏死、蛋白硝基化、核DNA断裂。6.应用PCL-1和生物发光活体成像系统没有检测到异烟肼(INH)给药后Alb-Luc小鼠活体水平氧化应激信号,病理结果也并没有显示INH能导致肝损伤。7.应用PCL-1检测氧化应激的生物发光信号时会存在信号衰减情况,并且在损伤剂量时(APAP 300mg/kg,CCl4 1ml/kg)信号衰减比低剂量(APAP 200mg/kg,CCl40.5ml/kg)时慢,当再次给予PCL-1时,损伤剂量还可以再次观察到信号,而低剂量则没有上述情况。应用GSH可以使300mg/kgAPAP信号衰减更快,200mg/kg APAP和0.5ml/kgCCl4联合使用可以延长氧化应激信号并造成肝脏病理损伤。结论:本课题利用PCL-1和生物发光活体成像系统,实现了在活体水平检测肝损伤状态下的氧化应激,建立了能够评价药物肝损伤的可视化小鼠模型。我们应用该模型能够快速、准确的评价APAP和CCl4导致的药物肝损伤,并且我们还发现在损伤剂量时产生的氧化应激信号持续时间更长,应用该模型可以更灵敏的诊断肝损伤的程度。本模型填补了肝损伤过程中的影像学活体评价指标的缺失,可以为肝损伤的形成过程和转归提供动态的、可活体观察的小鼠模型,为药物的肝毒性的检测和治疗效果的评估提供了可靠的手段。