随着新生儿学的发展，早产儿的存活率大幅度提高，但支气管肺发育不良（BPD）的发病率反而逐年增加，严重影响存活儿的生长发育和生存质量。BPD是新生儿，尤其是早产儿高氧机械通气治疗最常见的并发症，但至今其发病机制尚不完全清楚，临床上尚无理想的药物可以防治BPD。目前，以肺发育受阻为主要病理改变的“新型BPD”倍受关注。研究表明，BPD发生过程中炎症反应持续存在，而炎症能抑制出生后肺泡、小呼吸道和小血管的发育。细胞凋亡参与肺损伤的发病过程，肺泡上皮细胞的死亡是高氧性肺损伤的一个重要特征之一。高氧性肺损伤时由于Ⅱ型肺泡上皮细胞变性及破坏，肺表面活性物质相关蛋白（SP）分泌下降，使肺表面活性物质不能有效发挥其生物学作用，阻碍肺泡发育成熟。因此，呼吸道重塑的关键时期发生肺损伤可导致肺发育阻滞。Clara细胞分泌蛋白（CCSP）是位于远端细支气管的无纤毛立方形上皮细胞-Clara细胞分泌的蛋白，是分泌型磷脂酶A₂（PLA₂）的抑制剂，具有抗炎等多种生物活性，参与体内一系列生理、病理过程，如炎症、组织重建等。CCSP在体内通过PLA₂的抑制作用，减少肺表面活性物质的降解、肺弹性回缩力的减弱及肺残气量的增加。Ramsay等研究报道，呼吸窘迫综合症患儿生后1d、3d、6d的支气管肺泡灌洗液中CCSP含量越低，将来越容易发展成BPD，提示BPD的发生与CCSP的变化高度相关。但国外诸多研究结果认为外源性CCSP可能通过抗炎机制，减轻肺损伤，尚未见与凋亡关系的研究报道。因此，为了探讨BPD发生过程中肺内CCSP与肺泡上皮细胞凋亡之间的关系，本研究从组织、分子水平观察了BPD不同时程肺组织形态学改变及肺内CCSP、肺表面活性物质蛋白-A（SP-A）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达变化和细胞凋亡程度，以探讨高氧对肺发育和肺损伤的影响及其机制。此外，应用rh-CCSP进行体内外干预后，进行动态观察肺发育和肺内SP-A的表达及肺细胞凋亡程度，阐明了rh-CCSP对高氧性肺损伤的保护作用。本研究不仅对新生儿呼吸病理生理的理论意义，也为今后临床应用rh-CCSP防治BPD提供有力的理论和实验依据。实验结果如下：一、高氧性肺损伤的机制研究1．高氧对新生大鼠死亡率的影响随着暴露时间的延长，各组死亡率均呈增高趋势。空气组增高缓慢，而高氧组暴露7d后开始死亡率迅速增高，与空气组相比，差异有显著性，P＜0.01。2．高氧暴露后肺损伤情况高氧暴露不同时期W／D值比较来看，空气组和高氧组3d时，W／D值无明显差异，P＞0.05；高氧暴露7d、10d时，高氧组W／D值较空气组明显增加，差异有显著性，P＜0.05；但14d时，差异不明显，P＞0.05。高氧暴露后3d、7d的支气管肺泡灌洗液（BALF）中丙二醛54（MDA）含量明显高于空气对照组，差异有显著性意义，p＜0.01。3．高氧暴露后肺形态学变化空气组3d时，肺组织基本结构单位为终末囊泡，腔大壁厚，分隔已开始，有脊突向腔内，囊泡壁内许多间质细胞，肺泡数目少；高氧暴露3d时，肺组织表现基本同空气组。空气组7d、10d时，脊明显增多，肺泡数目也渐增加；高氧组肺泡数目较空气组减少。空气组14d时，肺泡数目增加更显著，肺组织基本结构单位为肺泡，但肺泡壁较厚，仍有较多间质细胞；而高氧组肺组织结构紊乱，肺泡形成明显滞后，肺泡结构简单化和囊泡化。4．高氧对新生大鼠肺组织CCSP、SP-A、TNF-α表达的影响高氧组Clara细胞百分率明显少于空气组，差异有显著性，P＜0.01；高氧组Clara细胞免疫阳性强度与空气组相比，差异有显著性，P＜0.01。随着高氧暴露时间的延长，Clara细胞阳性率和CCSP表达强度降低，差异均有统计学意义，P＜0.05。高氧暴露7d，两组SP-A表达强度比较，差异无显著性，P＞0.05；但高氧暴露14d后结果与早期相反，高氧组SP-A表达较对照组明显减少，差异有显著性，P＜0.01。western blot方法观察肺组织内SP-A表达，并进行半定量分析结果，高氧暴露3d时SP-A表达量高于空气组，差异有显著性，P＜0.05；高氧暴露5d、7d时两组之间无差异，P＞0.05。高氧组TNF-α的表达强度明显高于空气组，其表达在高氧3d时高峰，高氧7d时有所下降，但仍明显高于空气对照组，差异有显著性意义，p＜0.01。5．高氧对新生大鼠肺组织细胞凋亡的影响高氧暴露7d、14d时，肺上皮细胞凋亡指数明显高于空气组的测定值，差异有显著性，P＜0.01；随着高氧暴露时间的延长，细胞凋亡程度加重，但不同时程组间比较，差异无统计学意义，P＞0.05。二、rh-CCSP对A549细胞凋亡的影响高氧处量72h后A549细胞凋亡率较空气组明显增多，差异有显著性意义，P＜0.01；高氧+rh-CCSP组细胞凋亡率较高氧组明显减少，差异有显著性意义，P＜0.01；随着高氧处理时间的延长，细胞凋亡率增加。三、rh-CCSP对高氧性肺损伤的影响研究1．RAC值和形态定量分析：rh-CCSP组较高氧组RAC值明显增高，肺泡面积比明显减少，差异有显著性，P＜0.01。2．SP-A表达：高氧暴露7d时，各组SP-A表达水平，差异无显著性意义，P＞0.05。但高氧暴露14d时rh-CCSP+高氧组较高氧组表达强度增强，差异有显著性意义，P＜0.05。3．TUNEL染色结果：高氧暴露7d时，rh-CCSP组细胞凋亡指数明显低于高氧组的测定值，差异有显著性意义，P＜0.01。结论1．长时间暴露于85％高浓度氧可引起新生鼠肺损伤和肺发育阻滞。主要表现为肺W／D比值增加和肺泡数目减少、结构紊乱、RAC值减少等肺组织形态学的改变及死亡率上升。2．高氧诱导肺细胞凋亡是BPD的重要机制之一，高氧可能通过增加TNF-α表达来诱导细胞凋亡。3．Clara细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞是氧化损伤的主要靶细胞，因高氧致Clara细胞损伤，进而抑制CCSP分泌，加重肺损伤；随着高氧暴露时间的延长Ⅱ型肺泡上皮细胞变性、破坏，使SP-A分泌减少，使PS功能丧失，阻碍肺发育，促进BPD发生。4．高氧暴露后A549细胞的凋亡增加，随着高氧暴露时间的延长，细胞凋亡程度加重，rh-CCSP能够有效抑制高氧暴露后肺上皮细胞的凋亡。5．高氧暴露后肺内CCSP表达下降，阻碍肺泡发育，外源性补充rh-CCSP可逆转高氧引起的肺泡化障碍，还能增加肺内SP-A分泌，有效抑制肺细胞凋亡，减轻肺损伤，可预防和治疗BPD的发生。本研究的创新点国内尚无CCSP与高氧、BPD关系的研究报道，更没有rh-CCSP对高氧性肺损伤的影响研究。本课题选择rh-CCSP的抗凋亡作用为突破口，通过促进肺细胞的增殖、分化，抗细胞凋亡作用机制，减轻高氧性肺损伤的作用机理领域进行了新的探讨。创新点：①国内首次进行重组CCSP与BPD、高氧性肺损伤的关系的实验研究；②国内外首次用雾化吸入的方法，研究rh-CCSP的影响及其机制。