论文部分内容阅读
背景与目的:胰腺癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,发病隐匿,进展迅速,一旦确诊,80%已出现转移,死亡率位居第五位,5年生存率不足5%,故寻找有效的诊治手段十分重要。随着分子生物学技术的进展,基因为胰腺癌的诊治带来了希望。胰腺癌的发生是以多个促癌基因的活化或/和抑癌基因的失活为基础的多步骤过程。研究表明,一些DNA片段在体外经转染或感染后可选择性地抑制肿瘤细胞的扩散和转移。1995年,Dong等首次从人前列腺癌杂交瘤细胞系中,克隆得到一株与肿瘤转移抑制有关的基因,简称KAI1基因。KAI1基因对胰腺癌抗转移作用的研究最早始于1996年,大量而深入的研究发现,该基因在胰腺癌中呈低或无表达时即出现转移,且早期病人的mRNA水平显著高于晚期有转移的病人,表明该基因具有抑制胰腺癌细胞迁移运动的能力。Dong等人通过将KAI1/CD82基因转染肿瘤细胞后,使CD82重新表达,结果表明转染后肿瘤细胞的侵袭和转移能力均下降,发现KAI1的表达与否和肿瘤的转移有关。肿瘤细胞中KAI1/CD82表达下降可导致肿瘤转移的机率增加,可见KAI1是一个肿瘤转移抑制基因。我们曾应用KAI1真核表达质粒转染人胰腺癌细胞系,发现转染后胰腺癌细胞生长受到抑制,迁移能力减弱;动物体内实验也发现经KAI1质粒注射的荷瘤裸鼠与对照组相比肝、肺转移灶减少,体积缩小。考虑到真核质粒基因转染率较低等缺点,故本实验通过构建Ad-KAI1腺病毒载体,进行胰腺癌细胞体外实验及裸鼠体内实验,观察KAI1基因对该肿瘤转移及生长的抑制作用,为胰腺癌的临床治疗提供进一步的实验证据。方法:实验一: KAI1基因感染胰腺癌细胞体外抑制细胞增殖及抗转移作用研究。(1)用E1区缺失的腺病毒载体构建表达人肿瘤转移抑制基因KAI1的重组质粒Ad-KAI1(本实验室构建)。(2)采用Transwell实验比较了诱导KAI1基因感染胰腺癌细胞系PANC I前后血管内皮细胞生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)等细胞因子的迁移作用。(3)检测细胞粘附分子(ICAM-1),金属蛋白酶9(MMP-9)在KAI1基因感染胰腺癌细胞系PANC I前后的表达水平。实验二:体内抑制胰腺癌细胞转移作用的实验治疗研究。本实验采用胰腺癌细胞系MiaPaCaⅡ构建了荷瘤裸鼠模型。将Ad-KAI1腺病毒载体治疗组、空Ad腺病毒载体空白对照组、生理盐水对照组直接注射入裸鼠荷瘤内,观察其抗转移作用:①基因治疗组、空Ad腺病毒载体组和生理盐水组裸鼠荷瘤的生长体积。②50天后活杀小鼠,对其肿瘤、肝脏、肺脏、进行称重。③实验组及对照组裸鼠肝脏、肺脏、淋巴结的光镜病理形态学观测及比较。结果:成功构建Ad-KAI1腺病毒载体;Transwell小室实验结果提示,在血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)的分别诱导下实验分组进行,Ad-KAI1感染胰腺癌细胞系PANC I后与感染胰腺癌细胞系PANC I前两组迁移作用比较有统计学意义(P<0.05);表明Ad-KAI1感染后胰腺癌细胞系PANC I迁移作用受到一定程度的抑制;VEGF、EGF对胰腺癌细胞起诱导作用。免疫细胞化学实验结果提示,胰腺癌细胞系PANC I中ICAM-1、MMP-9分别表达阳性;感染Ad-KAI1后的胰腺癌细胞系PANC I中的ICAM-1、MMP-9分别呈阴性表达。KAI1基因对胰腺癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长作用结果:Ad-KAI1治疗组、Ad组与生理盐水组相比肿瘤生长无明显差异性(P>0.05),但KAI1基因对裸鼠胰腺癌的转移有抑制作用。肺、肝重统计学分析Ad-KAI1组与生理盐水组的差异显著(P<0.05),Ad组与生理盐水组差异无显著性(P>0.05)。病理学改变是:生理盐水组裸鼠肺表面及实质内可见明显转移瘤灶,体积大,细胞呈圆形或多边形,排列紧密,胞质染色较浅,嗜伊红,细胞核核分裂多见。肺小淋巴结及小支气管内亦可见转移瘤灶形成;而Ad-KAI1治疗组肺转移灶数量少,体积明显减小,瘤细胞体积小,细胞之间有裂隙,核分裂少,肺内小淋巴结及小支气管内未见转移瘤灶形成;生理盐水组裸鼠肝脏瘤细胞排列紊乱,大小不一,异型性明显,细胞核增大且不规则。Ad-KAI1治疗组肝脏转移灶数量减少或无转移。结论:体外Transwell和免疫细胞化学实验提示,KAI1基因在胰腺癌细胞系PANC I内的表达可能是抑制胰腺癌迁移的有效途径之一,上调KAI1基因表达能明显降低胰腺癌细胞的转移能力;VEGF、EGF对胰腺癌细胞系PANC I转移起诱导作用;KAI1基因抑制ICAM-1、MMP-9在胰腺癌细胞系PANC I中的阳性表达;体内实验将KAI1基因对胰腺癌裸鼠肿瘤内进行注射具有抑制MiaPacaⅡ胰腺癌转移作用,进一步证明KAI1基因可能是通过抑制癌细胞在继发部位的生长而起到抑制胰腺癌转移作用。