第一章冻胚移植导致子痫前期风险增加的临床研究研究目的:据统计,在我国不孕症困扰着10%-18%的生育期女性,且发病率逐年递增,并趋于年轻化,严重影响人类健康。辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)是不孕症的有效治疗手段,且自问世以来世界范围内已有800余万辅助助孕新生儿诞生。然而其对妊娠期母婴安全及子代健康的影响一直是临床关注的热点问题。已有确凿临床证据表明,相较于自然妊娠过程,ART显著增加孕产妇及新生儿围产期并发症,包括子痫前期(pre-eclampsia,PE)的风险。子痫前期严重威胁母婴安全,发病率高达3%-5%,然而具体机制不明确。现有流行病学证据表明,糖尿病(1型或2型)、自身免疫性疾病、初产妇、高龄(≥40岁)、妊娠间隔时间≥10年,体重指数(body mass index,BMI)≥35kg/m2及多胎妊娠等高危因素均与该病的发生密切相关。我们课题组前期进行了一系列临床随机对照研究,结果发现冻胚移植后显著增加妊娠期子痫前期的风险。近期越来越多的国内外研究也证实了这一结果。然而,在ART中,其他因素是否也会增加妊娠期子痫前期的风险,以及具体哪些操作可能导致冷冻胚胎移植后更易发生子痫前期,口前尚不清楚。研究方法:对前期三个多中心随机试验中收集的数据进行了一个巢氏病例对照研究,研究主体为首次胚胎移植后获得临床妊娠的女性。将接受助孕女性的一般情况(包括年龄、BMI、血压、产次、不孕持续时间、不孕原因、性激素水平、子宫内膜厚度)、卵巢反应指标、受精类型(IVF或ICSI)、胚胎移植类型(鲜胚或冻胚、卵裂胚或囊胚)及胚胎移植数(单胎或双胎)等因素同时纳入多因素Logistic回归模型,以探究在辅助生殖过程上述因素对子痫前期发生风险的影响。结果:最终有2965例获得临床妊娠,其中有90例诊断为子痫前期,分为子痫前期组和非子痫前期组。两组比较发现,BMI(P=0.003)、收缩压(P<0.001)、舒张压(P=0.005)、双胎妊娠比例(P<0.001)、及冻胚移植比例(P=0.002)在子痫前期组明显升高。同时子痫前期组HCG日血清孕酮水平(P=0.016)、卵裂期胚胎移植数(P=0.049)也高于非子痫前期组。Logistic回归分析表明,双胎妊娠(OR 2.34,95%CI1.50-3.66,P<0.001),平均动脉压(OR 1.04,95%CI1.01-1.07,P=0.003),冻胚移植(OR 2.06,95%CI 1.27-3.35,P=0.003),体重指数(BMI)(OR 1.10,95%CI 1.02-1.18,P=0.010),HCG日孕酮水平(OR 1.53,95%CI 1.07-2.20,P=0.021),与子痫前期发生风险呈正相关,促性腺激素总剂量(OR 0.999,95%CI0.999-1.000,P=0.037,P=0.001)与子痫前期的发生风险呈负相关。限于冻胚移植组的Logistic回归分析,结果表明双胎妊娠(OR 2.44,95%CI 1.43-4.18,P=0.007),BMI(OR 1.13,95%CI 1.03-1.23),促性腺激素总剂量(OR 0.999,95%CI 0.999-1.000,P=0.014)仍与子痫前期发生明显相关。而胚胎移植阶段(卵裂期或囊胚期)、冻胚移植前子宫内膜准备方案均未发现与子痫前期发生有相关性。结论:冻胚移植是辅助生殖技术中子痫前期风险增加的独立危险因素,卵巢高反应可能与子痫前期发生风险相关,而卵裂胚或囊胚阶段移植可能与子痫前期发生无相关性。第二章冻胚移植后胎盘组织的转录组测序及甲基化芯片分析研究目的:冻胚移植妊娠后子痫前期风险增加,而其潜在机制目前尚不明确,亟需深入研究探讨。与鲜胚移植相比,冻胚移植可待母体激素水平恢复正常后再行胚胎移植,可避免将胚胎置于子宫高雌激素的环境中,为胚胎植入及胎盘形成提供接近生理状态的条件,理论上更有利于妊娠的发生和维持。同时,胚胎冷冻过程正是施于卵裂球期至囊胚期的早期胚胎发育阶段,此时基因组对环境的干扰非常敏感,甲基化状态经历大规模重编程,已有研究表明,胚胎冷冻过程可影响印记基因及microRNA的表观遗传学调控,进一步导致蛋白表达紊乱,从而引发胚胎及胎盘发育异常,继而出现妊娠相关并发症。本研究拟对不同来源的胎盘组织进行转录组测序及甲基化芯片分析,结合生物信息学技术分析差异表达基因及差异甲基化基因,以寻找冻胚移植妊娠后子痫前期风险增加的致病靶点。研究方法:收集鲜胚移植正常胎盘、冻胚移植正常胎盘、冻胚移植子痫前期胎盘各4例,进行高通量mRNA测序(mRNA Sequencing,mRNA-Seq)及DNA甲基化芯片分析(850K芯片),通过生物信息学分析,筛选差异表达基因及差异甲基化基因。然后对筛选的基因在胎盘组织中进行扩大样本验证,包括鲜胚移植正常胎盘及冻胚移植正常胎盘各12例,采用实时定量荧光PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法进行差异表达基因mRNA水平验证;DNA甲基化水平采用亚硫酸氢盐处理后测序(Bisulfite sequencing PCR,BSP)方法进行差异甲基化基因的验证。结果:根据基因功能及在胎盘中的表达丰度,在mRNA-Seq中筛选出27个差异表达基因进行扩大样本量mRNA水平验证;结果显示前列腺素六次跨膜蛋白(Six-Transmembrane Epithelial Antigen Of Prostate 3,STEAP3)、胎盘胶原样凝集素1(Collectin Placenta 1,CL-P1)在冻胚移植正常胎盘中表达明显下降。在DNA甲基化芯片分析中筛选出11个差异甲基化基因,采用BSP方法进行扩大样本的甲基化水平验证,结果显示在冻胚移植正常胎盘中前动力蛋白1(Prokineticin 1,PROK1)启动子区域显著高甲基化改变。GO功能富集KEGG通路富集分析显示,差异基因在细胞生长与分化、妊娠过程、细胞因子受体、细胞外基质、炎症通路等方面明显富集。结论:冻胚移植妊娠后胎盘组织的mRNA转录组表达及DNA甲基化水平均发生明显改变。STEAP3及CL-P1基因表达异常、PROK1启动子区甲基化改变可能参与了冻胚移植后子痫前期风险增加的机制调控。第三章STEAP3在HTR-8/Svneo滋养细胞中的功能研究研究目的:根据第二章的测序及验证结果,相较于鲜胚移植组,冻胚移植妊娠后胎盘组织中STEAP3的mRNA表达量明显下降,那么STEAP3的表达改变是否与子痫前期的发病机制相关呢?对子痫前期的发病机制的研究仍处于探索阶段,普遍认可的学说为滋养细胞侵袭功能异常诱发子宫螺旋动脉重塑障碍是导致子痫前期发病的关键因素。绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblast cells,EVT cells)的正常分化在子宫螺旋动脉重塑过程中发挥重要作用。EVT细胞在侵袭母体蜕膜组织的同时不断持续分化,可分化为间质途径来源的EVT细胞及血管内皮途径来源的EVT细胞。间质途径EVT细胞具有高度侵袭性,不断侵袭母体蜕膜组织并将胎盘植入于母体蜕膜肌层,而血管内皮途径EVT细胞则穿透血管管腔进入蜕膜深部,获得血管内皮样表型,并取代子宫螺旋动脉细胞。子宫螺旋动脉的正常重塑过程有利于维持母胎循环之间营养物质的充分交换,从而促进胚胎的正常发育。反之,EVT细胞的分化及功能异常则导致子宫螺旋动脉重塑受损,从而影响胚胎及胎盘的正常生成,导致子痫前期等妊娠并发症的发生。STEAP3(前列腺六次跨膜蛋白)属于金属还原酶家族,可将三价铁还原为二价铁,在铁离子代谢中发挥重要作用。而铁离子密切参与DNA及ATP的合成过程,是细胞存活及增殖不可或缺的因素之一。STEAP3可促进铁离子的摄取,维持铁离子的储备,并可在低铁环境下维持肿瘤细胞的快速繁殖。同时STEAP3作为TP53下游调节基因,参与调控肿瘤细胞的凋亡及增殖过程。STEAP3在胎盘组织中较高水平表达,但在生殖相关领域的研究未见报道。本章研究拟对STEAP3在滋养细胞中的功能进行探讨,以明确STEAP3表达异常是否参与冻胚移植导致子痫前期风险增加的相关机制调控。方法:收集鲜胚移植正常胎盘、冻胚移植正常胎盘及冻胚移植子痫前期胎盘,采用Western blot的方法检测不同来源胎盘组织中STEAP3中的蛋白表达量。体外培养HTR-8/Svneo滋养细胞,利用小干扰RNA技术转染细胞,降调细胞中STEAP3表达水平,采用CCK8细胞增殖实验检测转染后滋养细胞的细胞增殖活性,采用Transwell小室检测转染后滋养细胞的迁移与侵袭能力;采用管腔形成实验检测转染后滋养细胞的内皮样管腔形成能力。结果:Western blot结果显示,冻胚移植子痫前期组STEAP3蛋白表达量明显低于鲜胚移植正常组和冻胚移植正常组,且冻胚移植正常组显著低于鲜胚移植正常组。降调HTR-8/Svneo滋养细胞中STEAP3表达后,细胞的增殖活性减弱,迁移与侵袭能力降低,内皮样管腔形成能力减退。结论:降调STEAP3可抑制滋养细胞增殖,降低细胞迁移及侵袭能力,影响滋养细胞内皮样管腔形成能力。冻胚移植后胎盘组织中STEAP3表达下降可能是冻胚移植导致子痫前期风险增加的机制之一。