黄檗叶黄酮类化合物的分离纯化及活性研究

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黄檗是我国传统名贵中药黄柏的重要植物来源,其入药部位主要是黄檗的树皮,而黄檗叶子等其他部位尚未得到有效利用。研究发现,黄檗落叶对周围植物具有化感作用,并且亦会抑制自身种子的萌发,因此,黄檗落叶限制了其自我更新的能力。此外,由于黄檗巨大的药用价值,市场需求量很大,在供给关系的严重失衡以及利益的驱使下,加剧了人们对野生黄檗资源的掠取,黄檗资源因此遭受严重破坏。本文从黄檗叶中提取、分离纯化黄酮类化合物,对其进行活性研究,充分有效地利用黄檗资源有助于缓解黄檗自我更新的障碍,有利于生态系统中生物多样性的形成,保护处于濒危状态的黄檗资源。本论文研究包括以下三个方面:黄檗叶黄酮类化合物提取方法的优化;黄酮类化合物的分离纯化及分离得到单体化合物的结构测定和活性测定。通过单因素实验和正交实验确定最佳提取条件为:料液比为1:20,乙醇浓度为60%,提取温度为70℃,提取时间为2.5小时,回流提取2次。通过光谱扫描和颜色反应等实验初步确定提取液中主要含有二氢黄酮醇类成分。将利用最佳提取工艺得到黄檗叶黄酮粗提液将其进行纯化分离,首先利用石油醚萃取除去色素和酯类等杂质,再用乙酸乙酯进一步萃取得到黄酮萃取液(PLF)。黄酮萃取液经过硅胶柱层析,以不同比例的甲醇和氯仿作为洗脱剂进行梯度洗脱,通过薄层层析法检测组分,通过抗氧化实验筛选具有活性的组分,液相色谱检测分析活性组分中主要含有三种成分(PLF1、PLF2、PLF3),将其通过制备液相纯化得到一种黄酮单体,再经高分辨液质联用仪确定其分子量及分子式,经核磁共振波谱仪分析其分子结构,最终确定所得黄酮单体为黄柏苷(PLF3)。通过FRAP法、DPPH法、超氧阴离子自由基清除实验分别对黄酮粗提液、黄酮萃取液(PLF)及黄柏苷(PLF3)进行活性研究并加以比较,实验表明,三者都具有抗氧化活性,经过纯化的黄酮萃取液其抗氧化能力高于未经任何纯化的黄酮粗提液(PLF),黄柏苷(PLF3)亦具有较强抗氧化活性,在浓度为4mg/mL时,DPPH自由基清除率达到92.87%,FRAP法测定其总抗氧化能力随着浓度的升高而增强。实验还表明黄酮萃取液能有抑制肿瘤细胞DNA拓补异构酶Ⅰ的活性,这说明黄檗叶黄酮类化合物具有潜在的抗肿瘤作用,并通过MTT法确定了黄檗叶黄酮对肿瘤细胞有一定的抑制作用。
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