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第一部分急性髓细胞白血病患者全基因组5-m C水平检测【目的】探讨髓系恶性肿瘤急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者全基因组5-甲基胞嘧啶(5-m C)水平及地西他滨对5-m C的影响,分析与AML患者临床特点的关系及对预后的影响。【方法】以2013年1月至2014年12月于苏州大学附属第二医院血液科就诊的42例AML(男性22例,女性20例,中位年龄63岁)经地西他滨20mg/(m2·d)×3~5d方案联合化疗治疗的患者为研究对象,分别于地西他滨去甲基化治疗前1天、治疗后1天及治疗后7天采集外周血,采用全基因5-甲基胞嘧啶定量分析法检测外周血中5-m C含量。42例AML患者按病期分为初治组(20例)、复发难治组(10例)、缓解组(12例),其中以缓解组作为阳性对照组,另以13例缺铁性贫血患者作为正常对照组。【结果】(1)正常对照组5-m C含量为0.043±0.018ng,阳性对照组为0.052±0.022ng,两组5-m C含量相当,差异无意义(p>0.05);初治组和复发难治组5-m C含量分别为0.160±0.089ng、0.270±0.136ng,明显高于正常对照组和阳性对照组,并且复发难治组高于初治组(p<0.05)。(2)地西他滨去甲基化治疗后1天及7天,阳性对照组5-m C含量分别为0.050±0.016ng和0.046±0.009ng,较治疗前无明显变化(p>0.05);初治组5-m C含量分别为0.084±0.030ng和0.055±0.028ng,均较治疗前下降,并且两者差异亦有意义(p<0.05);复发难治组5-m C含量分别为0.190±0.127ng和0.142±0.112ng,较治疗前降低(p<0.05),但两者间无明显差异(p>0.05)。(3)治疗后获CR患者5-m C含量为0.063±0.037,NR患者5-m C含量为0.127±0.105,与正常对照组比较,CR组接近正常,NR组显著高于正常(p>0.05)。(4)治疗前5-m C水平与患者临床特征,如性别、年龄、FAB分型、原始细胞数、外周血细胞计数(白细胞、血红蛋白、血小板数)无明显相关性(p>0.05)。(5)治疗前5-m C水平影响AML患者的OS及DFS,5-m C低于中位水平0.113ng的患者较高于0.113ng的患者OS和DFS长。【结论】(1)初治及复发难治的AML患者全基因组甲基化水平升高。(2)地西他滨去甲基化治疗后全基因组甲基化水平下降,缓解后接近正常。(3)全基因组甲基化水平对AML患者的OS及DFS有影响。第二部分急性髓细胞白血病患者干细胞相关转录因子Sox2、Oct4、Klf4、C-Myc和Nanog启动子区甲基化状态检测【目的】探讨髓系恶性肿瘤急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)干细胞相关转录因子Sox2、Oct4、Klf4、C-Myc和Nanog启动子区甲基化状态及地西他滨治疗后甲基化状态改变情况,并分析对预后的影响。【方法】以2013年1月至2014年12月于苏州大学附属第二医院血液科就诊的42例AML(男性22例,女性20例,中位年龄63岁)均经地西他滨20mg/(m2·d)×3~5d方案联合化疗治疗的患者为研究对像,分别于地西他滨去甲基化治疗前1天及治疗后7天采集外周血,采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术检测患者外周血中Sox2、Oct4、Klf4、C-myc和Nanog基因启动子区甲基化状态及去甲基化治疗后改变情况。42例AML患者按病期分为初治组(20例)、复发难治组(10例)、缓解组(12例),其中以缓解组作为阳性对照组,另以13例缺铁性贫血患者作为正常对照组。【结果】(1)正常对照组中仅Sox2和Nanog基因检测到甲基化,阳性率为15.4%和30%;阳性对照组中Sox2、Oct4、Klf4、C-myc和Nanog基因甲基化阳性率分别为50%、50%、41.7%、33.3%和100%,明显高于正常对照组(p<0.05)。初治及复发难治的30例患者中均检测到Sox2、Oct4、K lf4、C-myc和Nanog基因甲基化,阳性率分别为90%、76.7%、70%、86.7%和100%,除Nanog基因,余基因甲基化阳性率均高于两对照组(p<0.05)。(2)治疗前初治组Sox2、Oct4、Klf4、C-Myc和Nanog基因甲基化率分别为85%、75%、70%、80%和100%,复发难治组分别为100%、80%、70%、100%和100%,均高于正常对照组(p<0.05),但两组甲基化率接近(p>0.05)。Sox2和C-Myc基因在初治和复发组中甲基化率高于阳性对照组(p<0.05),余基因在三组间差异无意义(p>0.05)。(3)地西他滨去甲基化治疗后,阳性对照组各基因甲基化率无显著变化(p>0.05);初治组Sox2、Oct4、K lf4和C-Myc基因甲基化阳性率分别为33.3%、40%、21.4%、45%,与治疗前比差异有意义(p<0.05);复发难治组Sox2、K lf4和C-Myc基因甲基化阳性率较治疗前降低,分别为33.3%、0%和50%,差异有统计学意义(p<0.05)。(4)各基因甲基化率与患者性别、年龄、FAB分型、原始细胞计数、血细胞计数无明显相关性(p>0.05);存在Sox2或Oct4基因甲基化的患者OS及DFS短于未甲基化者,共存Sox2和Oct4基因甲基化的患者较仅存在一种基因甲基化的患者OS缩短。【结论】(1)AM患者存在干细胞相关转录因子Sox2、Oct4、Klf4、C-Myc和Nanog启动子区甲基化。(2)地西他滨去甲基化治疗后Sox2、Oct4、Klf4和C-Myc甲基化阳性率下降。(3)Sox2和Oct4基因甲基化对预后有重要影响。第三部分骨髓增生异常综合征患者TET2、DNMT3A、ASXL1基因突变研究【目的】探讨髓系恶性肿瘤骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者TET2、DNMT3A和ASXL1基因突变与临床特征的关系及对预后的影响。【方法】釆用基因组扩增直接测序法检测2013年3月至2014年9月于苏州大学附属第二医院血液科就诊的20例MDS患者(男性12例,女性8例,中位年龄66岁)骨髓中TET2(exon3、exon11)、DNMT3A(exon23)、ASXL1(exon12)基因的突变情况,以6例健康供者外周血标本作为正常对照。【结果】(1)正常对照中均未检出TET2、ASXL1、DNMT3A基因突变;20例MDS患者中3例(15%)检测到TET2基因突变,1例纯合突变,2例杂合突变;4例(20%)检测到ASXL1基因突变,2例纯合突变,2例杂合突变;未检测到DNMT3A基因exon23突变。1例存在TET2和ASXL1共突变,1例存在ASXL1 2处突变。(2)TET2及ASXL1突变在各亚型、染色体核型、危险分层间突变率无差异;突变患者与野生型患者性别、年龄、外周血细胞计数等无明显差异(p>0.05),TET2突变、ASXL1突变对生存时间无显著影响(p>0.05)。【结论】(1)TET2、ASXL1基因突变在MDS患者中常见(突变率>10%)。(2)由于本实验病例数尚少,TET2、ASXL1基因突变对生存时间的影响尚不确定。