胰岛素样生长因子结合蛋白-1基因克隆、表达及功能研究 胰岛素样生长因子结合蛋白－1（Insulin－like growth factor binding Protein IGFBP-1）是重要的内分泌激素之一。它的生物学作用及作用机 制仍未完全阐明。我们根据 分子生物学、生物信息学理论，采用基因重组、 酵母双杂交、细胞培养、CAM及鸡胚神经背根节培养等技术对IGFBP－1进行 了系列研究。全文共分三个部分 一、为了获取IGFBP－1基因和蛋白，本研究采用PCR方法，从人胎肝cDNA 文库中成功钓取了IGFBP-1基因。并采用基因重组技术，构建了 IGFBP-1融合表达载体，首次利用IGFBP-1与GST基因融合表达方式， 实现了重组IGFBP-1在原核细胞中的高效表达，采用亲和层析法和凝 血酶切割分离获得纯度达85％以上的重组IGFBP-1蛋白。 二、为发现IGFBP-1可能的生物学作用及作用机制，首次采用酵母双杂交 技术对IGFBP-1进行了研究。结果发现野生型IGFBP-1具有转录激活 活性。根据生物信息学的理论和技术，分析了IGFBP-1结构和功能关 系，确定和构建了两个突变体M1、M2，结果突变体M2成功地将IGFBP-1 转录激活活性缺失。最后，利用酵母双杂交技术从人胎肝cDNA文库中 筛选出7个与IGFBP-1突变体M2相互作用蛋白。核酸序列分析及同源 检索显示 分别为肝癌细胞相关抗原-112（HCCl-112）、半脱氨酸蛋白 水解酶抑制剂、金属硫蛋白(Mt）、纤维蛋白原β链(Fg)、自主复制 序列(ARS）、血红蛋白(Hb）、结合珠蛋白(HP）。它们大部分是新发 现的可能和IGFBP-1发生相互作用的蛋白质。分析这些蛋白提示它们 可能是IGFBP-1代谢或生物学作用的部分环节或途径，也可能预示着 IGFBP－1新的生物学作用线索。如IGrBP－1与HCC－112结合可能参与 抑制癌细胞增殖，半脱氨酸蛋白水解酶抑制剂可能与IGFBP-1降解及 代谢有关，ARS在癌症、DNA复制、细胞增殖方面与IGFBP-1作用相反， Fg和IGFBP-1在血管平滑肌细胞增殖、移行方面作用刚好相反。而与 3军医进修学院博士学仁论又 中d简要 Hb、HP、Mt的结合尚无法理解。 三、为研究IGFBPd对血管、神经生长的影响及对KF刁调节作用，采用 MTT法第一次报道了IGFBP刁对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞株 BCV304细胞增殖的影响及对兀F刁的调节作用。结果发现IGFBP习 显著抑制其生长，IGF习具有明显的促内皮细胞株ECV304增殖作用， IGFBP－l能够抑制兀F－1促生长作用。本研究还发现在体外IGF－1可 以增强IGFBP刁抑制细胞增殖作用，这与传统的IGF习中心学说不一 致，值得关注。在鸡胚神经背根节培养实验中未观察到所设IGF习、 IGFBP1等组别对神经背根节生长有影响。最后采用“M技术在体研 究了IGFl、IGFBP叫对鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的影响。结果发现 IGF－1具有显著的促血管生长的作用，而IGFBP－1能够部分抑制这个 作用，但IGFBP－1本身对血管生长影响不明显。 结论 本文采用了一些先进技术和新方法应用于IGFBP习研究。实现了 IGFB卜1基因克隆和原核细胞高效表达，并新发现了一些与IGFBP刁 相互作用蛋白，它们可能是IGFBP1作用机制或自身代谢过程的部分 环节，为进一步研究提供了有意义的线索。研究了IGFBP叫对内皮细 胞生长、血管、神经方面的新功能。结果表明IGFBP＊是一个具有重 要生物学意义的蛋白质。