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目的:①应用酵母双杂交技术筛选人乳腺癌细胞MCF-7 cDNA文库中可与LRP16相互作用的蛋白;②确认LRP16与AR等核受体及NF-kB的相互作用;③研究LRP16对AR转录活性的调控作用及其对前列腺癌细胞系LNCap在不同浓度雄激素刺激下增殖的影响;④观察雄激素对LRP16表达的调控作用。方法:①pLPC-LRP16质粒经酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收,获得LRP16的基因片段,将其连接至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,经酶切验证其正确插入方向后,将重组诱饵质粒转化酵母菌AH109和Y187,并检测其在酵母中有无自激活作用和毒性。随后提取转化后的酵母总蛋白,经Western blot检测诱饵质粒在酵母中的表达情况,以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性。②将诱饵质粒pGBKT7-LRP16、MCF-7 ds cDNA文库片段及线性化质粒pGADT7-Rec共转化酵母菌AH109,在营养缺陷型培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上筛选阳性菌落。提取阳性克隆质粒进行PCR,将PCR产物测序,并将酵母质粒转化感受态大肠杆菌Top10获得与诱饵质粒有相互作用的单个文库质粒,测序后回复验证其在酵母中的相互作用。③用免疫共沉淀(Co-IP)及GST pull-down等体内、体外的方法验证LRP16与ART-27的相互作用;进一步采用GST pull-down确认LRP16与AR等核受体及NF-kB直接的相互作用,并验证了LRP16与AR相互作用的结构域;④荧光素酶报告基因检测LRP16对AR转录激活的影响及AR对LRP16启动子的调控作用;⑤采用MTT检测抑制内源性LRP16在不同雄激素浓度刺激下对LNCap增殖的影响;⑥在不同浓度及不同作用时间点睾酮刺激下,用Western blot检测LRP16蛋白表达水平的变化及在不同前列腺癌细胞系LRP16的表达情况。结果:①重组诱饵质粒经酶切验证,片段大小和插入方向均正确,将其转化入酵母菌后无自激活作用和毒性,Western blot证实在酵母中重组诱饵质粒可正确表达人LRP16蛋白;②获得8个与LRP16相互作用的候选蛋白,选取4个在酵母中进行回复验证,其中有3个可生长出阳性克隆;③ART-27可与LRP16相互作用,且AR、ERβ、PPARα、PPARγ等核受体及NF-kB均与LRP16有直接的相互作用;④LRP16通过唯一的C端结构域与AR的LBD域相互作用;⑤在睾酮的作用下,过表达LRP16对AR的转录活性有增强作用,抑制内源性LRP16的表达可减弱AR的转录激活活性;⑥减少内源性LRP16表达可抑制不同雄激素水平下LNCap细胞的增殖;⑦低浓度的睾酮可使LRP16蛋白表达增多,睾酮作用3h即可使LRP16蛋白表达增多,且AR对LRP16启动子活性存在增强作用;③AR阳性的前列腺癌细胞系LNCap比AR阴性的前列腺癌细胞系DU145中LRP16蛋白含量高。结论:①应用酵母双杂交技术筛选出一族功能基本明确的可与LRP16相互作用的候选蛋白;②LRP16可与AR、NF-kB直接相互作用,且这种相互作用不依赖于ART-27的存在;③LRP16是部分核受体家族相互作用的蛋白因子;④雄激素反应性靶基因LRP16反馈增强AR的转录激活活性,是AR的共激活因子;⑤LRP16可能通过与AR相互作用调控雄激素敏感性前列腺癌细胞的生长。