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由于缺乏合适的应用于临床的替代材料,泌尿道的修复与重建一直是临床上比较棘手的难题。其中,尿道狭窄多由外伤、炎症、先天性尿道下裂及肿瘤等原因引起,既往多采用膀胱黏膜、包皮皮瓣、口腔黏膜等自体组织进行修复重建,但由于存在供区再次损伤,取材有限,易导致感染、尿瘘、尿道再狭窄、尿道憩室等并发症。因此,研究者尝试利用组织工程技术再造尿道上皮复合材料进行尿道重建。但复合材料回值体内易出现种子细胞凋亡、材料降解引起局部炎症反应,回植材料缺乏血供,导致组织纤维化增生,瘢痕形成,限制了其在临床上的进一步应用。纳米微囊技术具有缓释、保护负载蛋白活性等优点,PLGA是经美国FDA批准广泛应用于临床的高分子材料,VEGF能够特异性的刺激血管内皮细胞的增殖及新生血管的形成,增加血管的通透性,为替代组织提供良好地微环境。因此VEGF-PLGA纳米微囊为组织工程材料再血管化提供了一种新的思路和技术可能。本实验通过制备VEGF-PLGA纳米微囊,并考察其体外、体内的缓释性能,并与BMGA交联后复合口腔上皮细胞进行尿道修复重建,为尿道修复重建组织工程再血管化提供实验依据。 第一章纳米微球的制备与性能评估 1、目的 优化纳米微球的制备工艺,评估其性能参数。 2、材料和方法 以PLGA为载体材料,采用乳化-溶剂挥发法制备芯材药物(诺氟沙星)微球,以包封率、载药量、粒径及其分布等为评价指标,对诺氟沙星微球的处方和工艺因素进行单因素考察,在此基础上通过正交设计筛选出最优处方。对优选处方制得的诺氟沙星微球的外观形态、纳米微球粒径、包封率、载药量进行考察研究和评价。对最优处方制备的诺氟沙星PLGA微球进行体外释放研究,考察不同释放介质、不同释放条件下的体外释放情况,评价制备所得微球的体外缓释效果。 3、结果 建立了紫外分光光度计法测定诺氟沙星的标准曲线,用于诺氟沙星原料药相关性质及稳定性考察和微球制剂载药量、包封率的测定。处方前研究工作结果显示25℃时诺氟沙星在水中的平衡溶解度为10mg/mL。诺氟沙星的丙酮:水(1:9)溶液7天内稳定。通过单因素试验考察和正交试验对诺氟沙星PLGA微球的制备工艺和处方进行了优化,最优条件下制得的诺氟沙星PLGA微球样品的载药量为2.00±0.10%、包封率为98.98±2.75%。电子扫描显微镜进行观察,微球大小均匀,颗粒圆整,表面光滑。通过紫外分光光度计法用于微球体外释药的测定;建立了微球的体外释药标准曲线,确定了以37℃生理盐水溶液为释放介质的透析法进行制剂体外释放的测定。体外释放的结果表明诺氟沙星微球在体外释放条件下无明显突释效应,具有缓释效果,体外释放时间可以持续达到30天。 4、结论 本文通过乳化-溶剂挥发法制备理想的PLGA纳米微球,其制备方法可操作性好,获取量满意,符合本课题前期要求。通过正交优化实验研究掌握了诺氟沙星纳米微球的部分理化性质,为微球的制备提供了支持。通过处方优化制备的诺氟沙星PLGA纳米微球具有理想的载药量,较高的包封率和明显的体外缓释效果,达到下一步包裹蛋白活性芯材的技术要求。 第二章VEGF-PLGA纳米微囊的制备及体外缓释实验 1、目的 探讨双乳化-溶剂挥发法制备VEGF-PLGA纳米微囊的制备及体外缓释实验 2、材料和方法 以PLGA为载体材料,采用双乳化-溶剂挥发法制备芯材为活性生长因子的纳米微囊,以包封率、载药量、粒径等为评价指标,通过前期纳米微球的实验基础,通过正交设计筛选出最优处方。对优选处方制得的VEGF-PLGA纳米微囊的外观形态、纳米微囊粒径、包封率、载药量进行考察研究和评价。并对最优处方制备的VEGF-PLGA微囊进行体外释放研究,评价制备所得微球的体外缓释效果。 3、结果 通过单因素试验考察和正交试验对VEGF-PLGA微球的制备工艺和处方进行了优化,最优条件下制得的VEGF-PLGA纳米微囊样品。负染电子扫描显微镜进行观察,微球大小均匀,颗粒圆润。采用紫外分光光度计法用于纳米微囊体外释药的测定;确定了以37℃生理盐水溶液为释放介质的透析法进行制剂体外释放的测定,建立了其体外释药标准曲线。体外释放的结果表明VEGF-PLGA在体外释放条件下无明显突释效应,具有缓释效果,体外释放时间可以持续达到15天。 4、结论 本文通过双乳化-溶剂挥发法制备包裹VEGF的PLGA纳米微囊。通过单因素试验及正交优化试验探索乳化能量、乳化时间等因素对纳米微囊的影响。通过处方优化制备的VEGF-PLGA微囊具有良好的载药量,较高的包封率和理想的体外缓释效果,可满足植入替代组织局部持续缓释VEGF的要求。并为本实验进一步的开展,将VEGF-PLGA纳米微囊修饰支架材料应用于尿道重建的研究提供了前期实验基础。 第三章VEGF-PLGA纳米微囊修饰BAMG支架的试验研究 1、目的 包裹VEGF的PLGA纳米微囊修饰BAMG支架,并以口腔黏膜上皮细胞为种子细胞与支架材料复合进行细胞相容性试验。 2、材料和方法 采用不同的方法将前期制备的VEGF-PLGA纳米微囊与我实验室制备的BAMG支架进行复合,寻求最佳的纳米微囊与支架材料交联方法,并将修饰过的支架材料与口腔黏膜上皮细胞进行共培养,验证其细胞相容性及与细胞的复合能力。 3、结果 经过不同交联方式对比,VEGF-PLGA与BAMG支架交联良好,增加了支架材料的比表面积程度,其孔隙率不变,使细胞更易于黏附、生长,四唑盐比色法(MTT)、流式细胞仪检测及扫描电子显微镜观察,显示细胞活性、生长增殖良好。 4、结论 实验证明包裹VEGF的新型PLGA纳米微囊修饰支架效果良好,增加了支架材料的表面粗糙度及比表面积,易于口腔黏膜上皮细胞黏附更适合其作为种子细胞在支架材料上的贴附、生长、增殖和分化,为本实验体内部分的进一步开展提供了坚实的前期基础。 第四章口腔黏膜上皮细胞复合VEGF-PLGA修饰的BAMG支架重建组织工程尿道的研究 1、目的 探讨口腔黏膜上皮细胞作为尿路上皮细胞的替代种子细胞,种植于包裹VEGF的PLGA纳米微囊修饰的BAMG支架回植于兔模型组织工程尿道修复重建的研究。 2、方法 将前期制备的VEGF-PLGA纳米微囊交联于BAMG支架,与口腔黏膜上皮细胞复合,并分组进行兔模型的前尿道补片式替代重建手术(A组:单纯BAMG支架修复重建尿道组;B组:空白PLGA纳米微囊修饰的BAMG支架修复重建组;C组:包裹VEGF的PLGA纳米微囊修饰的BAMG支架修复重建组),每组分别术后1周,2周、1月、2月、3月行尿道造影,并处死后取替代段组织行包括大体标本观测,及HE、masson、免疫组化等相关组织学检测。 3、结果 兔模型尿道重建术后,尿道造影显示单纯BAMGgroup,空白PLGA修饰BAMGgroup术后均出现不同程度狭窄;空白PLGA修饰BAMG组术后2周出现轻度尿道狭窄,术后1月、3月尿道造影显示比术后2周尿道狭窄有所缓解,VEGF-PLGA纳米微囊修饰BAMG组尿道造影显示尿道通畅。大体标本观测显示单纯BAMG组、空白PLGA/BAMG组尿道组织替代段局部疤痕明显;VEGF-PLGA纳米微囊修饰BAMG组术后2周出现轻度局部黏膜挛缩,术后2周、1月替代段挛缩较前明显减轻,于术后2月、3月观测,替代段尿道于正常尿道无明显差别。HE、masson及免疫组化组织学检测单纯BAMG组及空白PLGA纳米微囊修饰BAMG组术后2周即出现组织纤维化、胶原蛋白大量沉着、胶原蛋白排列紊乱,空白PLGA纳米微囊修饰BAMG组较单纯支架组胶原蛋白沉积少;VEGF-PLGA修饰BAMG支架组少量胶原蛋白沉着,替代组织可见大量新生微血管生成,尿道管腔面细胞生长良好。 4、结论 VEGF-PLGA纳米微囊修饰的BAMG支架与口腔黏膜细胞复合后进行兔模型尿道修复重建,术后通过尿道造影、大体标本观察,组织学等系列检测,证明对比单纯BAMG回植,及空白PLGA纳米微囊修饰的BAMG回植,VEFG-PLGA纳米微囊修饰的BAMG组能够在替代组织局部形成新生血管,明显减少组织纤维化,在一定程度上减轻尿道重建段的疤痕挛缩及再狭窄的形成。实验证明VEGF-PLGA纳米微囊修饰的BAMG支架,能够局部持续缓释VEGF,促进修复重建段尿道组织再血管化及减轻疤痕形成,为组织工程尿道修复重建的研究开辟了新的思路。