卵子的形成是昆虫繁衍和种群维持的关键生理过程,这一过程依次经历前卵黄生成期、卵黄生成期、卵壳生成期及排卵受精期几个发育阶段。在卵壳生成期,卵巢中的滤泡上皮细胞合成并分泌一些特殊的结构蛋白,附着在卵细胞表面,形成一个复杂的胞外结构层即卵壳。昆虫卵壳具有保护胚胎、维持气体交换、防止水分流失、阻止病原体进入以及协助精子进入卵子等重要生理作用。昆虫卵壳干物质的96%是蛋白质[1],主要包括外层卵壳层和卵黄膜层两个结构层。卵壳结构及其功能是昆虫生物学研究的热点之一。滞育是大部分昆虫都具有的重要生命现象,是昆虫得以在自然界长期大量生存的原因之一。滞育可以发生在卵期、幼虫期、蛹期或成虫期。家蚕的滞育发生在囊胚期,即胚胎发育到中胚叶刚分节时细胞停止分裂,开始进入滞育期。家蚕是典型的卵滞育型昆虫,其滞育卵在自然条件下历经长达数月的冬季后,在翌年春季孵化。这段时期离不开卵壳的保护,因此卵壳在家蚕整个生活史的完成上起着尤为关键的作用。而家蚕的非滞育卵在自然环境中数天后会孵化,不需要经历数月的滞育期。由于这种特殊的卵滞育性的存在,家蚕卵壳不仅存在有别于其他昆虫的种间差异特征,还存在家蚕滞育性卵与非滞育性卵间的种内差异。本研究以鳞翅目模式昆虫-家蚕为研究对象,先在电镜下观察家蚕卵壳的表面结构,再利用双向电泳和质谱技术构建其蛋白质图谱,通过比较蛋白质组学的方法分析并鉴定滞育性卵壳和非滞育性卵壳中的蛋白质组成及表达差异,找到与滞育相关的特征蛋白质,以生物信息学方法分析其结构与功能。并利用qRT-PCR方法检测相应基因在卵巢中的表达量。得到的主要研究结果如下:1.家蚕卵壳的表面结构及蛋白质图谱的构建采用二化性家蚕品种大造,蚕卵分别在高温长光照(25°C)和低温黑暗(15°C)条件下催青,孵化后的蚕将分别产滞育卵和非滞育卵,以此为实验材料。首先用电镜扫描产下20 h后卵壳的表面结构,观察到两种卵壳间存在明显的结构差异:滞育性卵壳表面气孔较少,这与其滞育期的代谢减弱吻合,卵纹明显突起,推测这是滞育性卵的特殊结构以度过滞育期。然后提取卵壳的蛋白样品,应用2-DE获得其双向电泳图谱,选取丰度较高的蛋白点进行质量飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,共成功鉴定了两种样品的28个蛋白斑点,包括A类、B类、CA类、CB类和Hc类卵壳蛋白,建立了家蚕卵壳的蛋白质图谱。2.差异蛋白的鉴定与功能分析利用比较蛋白质组学的方法分析滞育性和非滞育性卵壳的蛋白质图谱,得到5个有明显差异的蛋白点,经MALDI-TOF-MS鉴定和数据库检索得以鉴定,分别是卵壳高半胱氨酸类蛋白(chorion class high-cysteine Hc-A protein 12,HcA12)、卵壳B类M2410家族蛋白(chorion class B protein M2410,B.M2410)、卵壳A类L11家族蛋白(chorion class A protein L11,A.L11)、卵壳B类L12家族蛋白(chorion class B protein L12,B.L12)以及卵壳CA类ERA家族蛋白(chorion class CA protein ERA.2,CA.ERA2)。其中差异最为明显的蛋白斑点被鉴定为HcA12蛋白,利用生物信息学的方法进一步分析该蛋白的疏水性、二硫键及二级结构和功能,结果均与Hc蛋白的特性相吻合。上述差异蛋白点的鉴定和功能分析结果为家蚕滞育的研究提供了参考依据。3.差异蛋白的基因结构分析及qRT-PCR验证为了验证双向电泳的实验结果,以化蛹9天的滞育性和非滞育卵巢组织为材料,利用qRT-PCR技术检测其中差异蛋白相应的基因的表达量。RT-PCR结果与双向电泳结果一致:四种基因在滞育性卵巢中的表达量都上调,尤其是高半胱氨酸类蛋白的基因在滞育性卵巢中明显过表达。该蛋白富含易形成二硫键的半胱氨酸残基,且分布在整个卵壳,与家蚕卵壳的坚固性和难溶性有密切关系[2]。由此推测,滞育性卵壳中部分Hc蛋白的过表达是为了在卵壳外层形成高度坚韧的、能抵御不良环境的覆盖层,从而保证胚子能够安全地度过滞育期。其他差异蛋白与滞育的相关性还有待于深入研究。这些结果为进一步研究家蚕卵壳蛋白与家蚕滞育的相关性奠定了基础。本实验的研究结果也表明利用经典蛋白质组学研究方法即双向电泳技术结合MALDI-TOF MS技术,可以有效分离并鉴定出滞育卵壳与非滞育卵壳中的差异蛋白质。