前言乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，占妇女癌症死亡率的首位，阐明其发生机理对诊断和治疗具有重要意义。微囊(Caveolae)是细胞膜系统中的一个十分重要的结构。微囊蛋白—1(Caveolin-1)是该结构的重要组成成分之一，在多种分化成熟的细胞(上皮细胞、脂肪细胞、内皮细胞)中表达。Caveolin-1在维系细胞的脂类代谢平衡、控制细胞的增殖和调节细胞的迁移等诸多方面发挥着重要的作用。近年来，微囊蛋白基因在肿瘤发生发展中的作用受到了广泛的关注。本研究运用免疫组化方法检测人类原发乳腺癌和正常乳腺组织中微囊蛋白—1的表达状况，分析该表达与某些临床病理因素相关性。实验材料与方法1．材料标本来源于辽宁省肿瘤医院，1997年—2000年手术切除的原发性浸润性导管癌组织84例。肿瘤组织经10％福尔马林固定，常规石蜡包埋。患者均为女性，年龄25—73岁，平均年龄46岁。对其进行分期和病理学分型，TNM分期以美国癌症研究委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)联合制定(1988年)的为标准。Ⅰ期11例，Ⅱ期5l例，Ⅲ期18例，Ⅳ期4例。其中高分化的13例，中分化的28例，低分化的43例。T115例，T249例，T311例。有腋下淋巴结转移者45例，无转移者39例。患者术前均未接受过放、化疗治疗。2．实验方法2．1石蜡包埋组织进行连续切片，厚度4μm，用于HE和免疫组化染色2．2免疫组化染色试剂：Caveolin-1多抗(sc-894)购于美国Santa Cruze公司，ER及CerB-2即用型、S-P超敏试剂盒(KIT-9710)和DAB酶底物显色试剂盒(DAB-0031)购于福州迈新生物技术开发公司。切片染色方法按链霉素抗生素蛋白—过氧化物酶(S-P)法试剂盒说明书步骤操作。抗Caveolin-1(1：100)、ER及CerbB-2均经高压修复预处理。抗原修复液为pH6.0柠檬酸缓冲液。经DAB染色后，苏木素对比复染，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。3．阳性判断标准盲法判定结果。每张切片分别由两位病理医师独立阅片，一致肯定为阳性者方被视为阳性。光镜下，每张切片选择5个高倍视野，每一视野计数100个肿瘤细胞。Caveolin-1定位于为细胞膜和／或细胞浆呈棕黄色颗粒，CerB-2定位于细胞浆，ER定位于细胞核。取正常乳腺组织导管上皮作为阳性对照。(1)按阳性细胞百分率计分，0-25％为0分，26％-50％为1分，51％-75％为2分，76％-100为3分。(2)按染色强度计分，无着色为0分，着色略深的为1分，较深的为2分。＜2分为阴性，2～5分为阳性。4．统计学分析统计学软件为SPSS11.0版。Caveolin-1与临床病理学因素相关性采用卡方检验，α=0.05，P值为双侧。实验结果caveolin-1是一种膜／浆表达蛋白，在正常乳腺导管上皮细胞和血管内皮细胞中广泛表达。84例原发性乳腺癌组织中caveolin-1呈阳性表达者38例(45.2％)。T1、T2、T3的阳性表达率分别为66.7％、41％、36.4％，三者间无统计学差异(P＞0.05)；但T1(≤2cm)和T2+T3(＞2cm)之间却有显著性差异(P=0.036)。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌中,caveolin-1阳性率分别为81.8％、45.1％、33.3％和25％，有统计学差异(P=0.047)。caveolin-1在腋淋巴结转移癌中阳性表达率为31.3％，淋巴结无转移癌病例中阳性表达率为66.7％，二者具有统计学差异(P=0.001)。84例乳腺癌中，CerbB-2的阳性率为38％(32／84)，ER的阳性率为45.2％(38／84)。caveolin-1的表达与乳腺癌的分化程度、ER受体、CerbB-2的表达和年龄等无关。讨论恶性肿瘤的发生具有多阶段、多因素的特征，其中涉及癌基因的突变和活化；抑癌基因的缺失或过甲基化及凋亡调解机制的紊乱等遗传性改变。许多研究表明Caveolin-1基因位于人类七号染色体q31.1，这个位置在恶性肿瘤中常常缺失，并且被认为该区域还有肿瘤抑制基因。这在人类原发乳腺癌组织及其MCF-7细胞系中也得到证实。另据报道Caveolin-1对细胞的增值和分裂起调控作用，乳腺和肺细胞系发生肿瘤转化时表达降低，反义抑制Caveolin-1或其显性失活形成的表达足以诱导细胞转化，而将其倒入纤维母细胞和乳腺肿瘤细胞系后可反转一些恶性特征，实际上Caveolin-1被认为是20个肿瘤抑制基因后选基因。本研究表明Caveolin-1广泛存在正常乳腺导管上皮和血管内皮细胞，而它在乳腺癌中表达显著降低，这于文献中报道的乳腺癌、肺癌、胃癌等多种肿瘤组织结果一致。对于Caveolin-1在肿瘤中表达下降分子学机制目前主要认为于Caveolin-1第132位密码子(P132L)基因突变及其启动子甲基化有关。Lee H等在人类原发乳腺癌中及其细胞系中发现有16％的Caveolin-1基因突变，Engelman Ja等在人类乳腺癌MCF-7和T-47D两种细胞系中发现Caveolin-1基因CPG区域广泛甲基化，蛋白表达下降；而在正常人类乳腺上皮却无甲基化现象，且蛋白呈高水平表达。但Chen ST在乳腺癌组织中却仅仅发现25％Caveolin-1蛋白CPG位点出现四种类型的甲基化，却无突变现象。大量实验证明Caveolin-1的架构区具有蛋白激酶抑制活性，能够抑制EGF-R、Raf、G蛋白、C-src酪氨酸激酶、MEK-1和ERK-2等许多与细胞增值、凋亡、粘附、运动相关的信号因子的活性，而这些因子又是激活P42-44MAPK及其上游核转录因子Jun、Fos以及Cyclin D的重要途径。本研究同时发现Caveolin-1表达与肿块大小在T1和T2+T3之间有统计学差异，并成负相关。所以乳腺癌中Caveolin-1表达下降，使其负向调控受到抑制；正常乳腺导管上皮及瘤细胞过度增值和凋亡失衡，可能成为最终导致肿瘤发生和发展的遗传因素之一。有关这方面的工作正在进行中。体内外实验还发现Caveolin-1能抑制表皮生长因子受体家族中的一种重要受体(Cerb B-2)酪氨酸激酶活性，Cerb B-2异常表达也能负向调控Caveolin-1。而本实验Cerb B-2阳性者Caveolin-1表达率(37.5％)虽然明显低于阴性者(61％)，却未显示出统计学差异，可能与总病例数中只有60％作了CerbB-2检测，导致组间例数较少有关。目前研究认为Caveolin-1有助于细胞粘附分子E-Cadherin／β-Catenin复合物的形成，从而加强细胞间的连接与通讯。Caveolin-1表达上调能减低乳腺癌、肺癌细胞的运动能力。此外Fiucci等发现Caveolin-1的存在于基质金属蛋白酶(MMPs)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达成负相关，本研究发现有腋淋巴结转移的乳腺癌中Caveolin-1表达明显低于无淋巴结转移者，且随着病期的早晚其表达成下调趋势，提示Caveolin-1表达下调可能通过影响乳腺癌细胞β-Catenin的分布和／或MMPs和WEGF、Cerb B-2基因的表达间接或直接提高肿瘤细胞的侵袭和转移能力。可见进一步探讨Caveolin-1与诸转移相关因子的关系能够加深我们对乳腺癌侵袭和转移成因的认识。Caveolin-1作为肿瘤抑制因子的作用机制已有大量文献报道，但在多种肿瘤甚至同一种肿瘤的研究中还有很多争论。Caveolin-1在肾透明细胞癌、前列腺癌组织中表达增高，并与淋巴结转移、分期成正相关，这于我们在乳腺癌组织中的研究结果矛盾。而对于Caveolin-1表达与乳腺癌激素ER Pg R的关系，Chrn ST和我们的结果一致认为二者无关，而Sagara Y却作出了相反的结论。众所周知，肿块大小、腋淋巴结转移、分期都是影响乳腺癌的预后的独立因素，本研究提示：Caveolin-1在乳腺癌中的表达与三者密切相关，因此探索Caveolin-1与乳腺癌预后的关系应成为下一阶段的重要课题。结论1．Caveolin-1在人类原发性乳腺癌中表达异常，其表达与肿块大小和腋淋巴结转移密切相关，并且随着病情的进展呈下调趋势。2．Caveolin-1阳性率与年龄、组织学类型、分化程度、CerbB-2和ER受体状况无关。