背景中医药治疗骨折和骨不连具有数千年的历史,用药独到、简便灵验,但由于成分复杂、基础研究落后,其优势尚未得到充分发掘。中药与生物材料的复合及其在组织工程骨构建中的应用,国外尚未见正式报导,国内在此方面的研究也处于刚刚起步的阶段。已有研究表明:中药淫羊藿来源的植物黄酮——淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅,分子量:676.67)可促进成骨细胞BMP和Cbfa1基因的表达,抑制间充质细胞的成脂分化;可通过发挥雌激素样作用,增加去卵巢大鼠的骨形成、抑制骨吸收。这些结果都暗示:淫羊藿苷可作为一种骨诱导活性因子用于骨再生研究。此外,淫羊藿苷来源广泛、提取工艺相对简单、性质稳定、易于储存、可耐受消毒灭菌,这些特性亦为组织工程支架材料的载药提供了方便。目的1.研究传统中药淫羊藿有效药理成分——淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,hBMSCs）增殖和成骨分化等生物学行为的影响,探讨其促进成骨分化的作用机制,评价淫羊藿苷作为一种新型成骨诱导信号分子替代生长因子应用于骨组织工程的可行性;2.构建仿生组装淫羊藿苷—壳聚糖/羟基磷灰石（淫羊藿苷—CS/HA）骨修复材料,探讨其理化性质和生物相容性;3.研究淫羊藿苷—CS/HA复合材料的体外释药行为和释药动力学;4.研究淫羊藿苷—CS/HA复合材料的体内成骨效能。方法1.淫羊藿苷对hBMSCs成骨分化的影响和机制研究hBMSCs的分离培养和鉴定健康志愿者经知情同意后,于髂骨抽取骨髓,经全骨髓培养、扩增后,对第二代细胞进行表型标志物鉴定和成脂、成软骨和成骨三向诱导,取第3代细胞用于试验。淫羊藿苷的细胞毒性试验将hBMSCs接种至96孔板中进行培养,5000细胞/孔,贴壁后加入150μl浓度为10^-9M～2.0×10^-4M的淫羊藿苷培养基和0.05%（v/v）DMSO培养基进行培养,用普通培养基作为对照,干预48h后采用MTT法检测各浓度淫羊藿苷对hBMSCs活力的影响。细胞增殖试验将hBMSCs接种于96孔板中进行培养,2000细胞/孔,贴壁后吸出原培养基,分别加入150μl浓度为10^-9～10^-4M的淫羊藿苷培养基进行培养,以DMSO培养基作为对照。于加液后第1、3、5、7和9d MTT法测定OD值,绘制细胞生长曲线。hBMSCs成骨分化试验将hBMSCs植入6孔板中进行培养,2×10⁷细胞/孔,贴壁后加入1.5ml浓度为10^-9M～10^-4M的淫羊藿苷培养基进行培养,以DMSO培养基作为阴性对照,rhBMP-2培养基作为阳性对照。于加液后3、7、11d裂解细胞,采用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒和BCA试剂盒分别检测ALP和蛋白浓度,根据公式ALP（U/g）=ALP/总蛋白量换算ALP含量;同上法培养细胞,于7、14、21d裂解细胞,骨钙素（OCN）Elisa试剂盒检测OCN表达量;采用NBT/BCIP染液对培养11d的hBMSCs进行ALP染色;采用茜素红染液对培养28d的hBMSCs进行钙化结节染色并定量。淫阳藿苷促进hBMSCs成骨分化的机制研究将hBMSCs植入6孔板中进行培养,2×10⁷细胞/孔,贴壁后加入DMSO培养基、10^-6M淫羊藿苷培养基、rhBMP-2培养基和10^-6M淫羊藿苷+rhBMP-2培养基进行培养。分别于1、4、7d采用RT-PCR方法对成骨相关基因ALP、OCN、OPN、Col-Ⅰ、Cbfa1、BMP-2、BMP-4和BMP-7mRNA的表达进行检测。将hBMSCs植入φ10cm培养皿中进行培养,5×10⁷细胞/皿,贴壁后加入4ml DMSO培养基、10^-6M淫羊藿苷培养基、rhBMP-2培养基和淫羊藿苷+rhBMP-2培养基连续培养14d,经提取总蛋白后进行Westernblot检测成骨相关蛋白Cbfa1、OCN、BMPs的表达;细胞爬片后进行OCN免疫细胞荧光检测。2.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的构建仿生组装CS/HA复合材料的构建、表征和生物相容性采用原位复合和冷冻干燥方法制备CS/HA复合材料,通过扫描电镜（SEM）、切片染色观察材料的孔隙结构,采用常规方法评估材料的密度、孔隙率、孔径;采用X线衍射仪（XRD）和傅立叶红外光谱（FTIR）分析材料的理化性质;制备材料浸提液,采用MTT法观察其对hBMSCs增殖的影响,将hBMSCs接种至材料表面,分别于第3d和第10d采用SEM观察细胞的数量和形态;将CS/HA复合材料植入新西兰兔背部肌袋,分别于术后1、4、8、12 w行组织切片观察材料的组织相容性和降解情况。仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的制备、表征和生物学相容性在CS/HA复合材料的制备过程中掺入淫羊藿苷,制备载药剂量分别为10^-7、10^-6、10^-5mol的淫羊藿苷-CS/HA复合材料。采用同上方法分析淫羊藿苷-CS/HA复合材料的理化性质,万能材料试验机测试材料的力学性能;制备材料浸提液,采用MTT法观察其对不同密度接种的hBMSCs增殖和成骨分化（ALP表达）的影响,采用SEM对其表面接种10d的细胞进行观察;通过溶血试验考查淫羊藿苷-CS/HA复合材料对红细胞的影响;通过热原试验考查淫羊藿苷-CS/HA复合材料热原性。3.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的体外释药行为将载药量分别为10^-7、10^-6、10^-5mol的淫羊藿苷-HA/CS材料置于盛有5mlPBS的密闭玻璃离心管中,37℃恒温振荡,分别于1、2、3、10、15、20、30、60、90 d定时收集全部溶液进行超高效液相色谱（UPLC）检测。通过精密度试验、重复性试验、加样回收率试验、稳定性试验考查设备的精密度、灵敏度和淫羊藿苷的稳定性,通过标准曲线换算供试品每次释药量,并将其进行累积绘制成释药曲线;采用Logarithmic模型对释药行为进行曲线拟合。4.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的体内成骨效能60只雄性新西兰大白兔随机分为5组（n=12）,麻醉后于右侧桡骨中段截骨制作长度为1.5 cm的骨缺损模型,将CS/HA和载10^-7、10^-6、10^-5mol淫羊藿苷—CS/HA复合材料随机植入骨缺损处,骨缺损模型组不植入材料。放射性核素骨扫描（ECT）检查:术后4 w各组随机选取4只动物于耳缘静脉注射^99mTc-MDP,3 h后置单光子核素扫描仪上检测骨缺损部位^99mTc-MDP浓聚情况,采集结束后在图像上选取相同面积的感兴趣区域（ROI）进行定量计数,ROI均值=计数/面积。大体标本观察和X线检查:术后4、8、12 w处死动物后收集右前臂尺桡骨进行大体观察和X线拍片检查。骨密度（BMD）检查:取各组术后12 w标本行骨密度检查,于电脑上选取桡骨缺损区域并计算该区域的骨矿含量（BMC）,BMD（g/cm²）=BMC/选取面积。组织学观察:各时间点组织标本经固定、脱钙、切片后行HE染色观察。结果1.淫羊藿苷对hBMSCs成骨分化的影响和机制研究全骨髓培养的第二代hBMSCs表面标志物鉴定结果分别为:CD29（93.98±6.32）%、CD44（85.98±3.87）%、CD71（72.19±4.66）%、CD105（79.28±7.37）%、CD166（97.42±7.43）%、CD14（0.95±0.06）%、CD34（1.45±0.38）%、CD45（0.73±0.11）%;经成脂、成软骨和成骨三向诱导后全骨髓培养法分离的细胞可分别向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞分化。高于10^-4M的淫羊藿苷具有一定的细胞毒性;培养基中0.05%（v/v）DMSO用量安全、无细胞毒性,可用于淫羊藿苷的助溶。浓度为10^-8M淫羊藿苷可促进hBMSCs的增殖。淫羊藿苷的促成骨分化作用（ALP表达）与剂量有关,浓度过低时(＜10^-8M)不能促进hBMSCs的成骨分化,浓度过高时(＞10^-5M)则抑制了hBMSCs的成骨分化。浓度在10^-8～10^-5M的淫羊藿苷可促进OCN的表达;在第11d的ALP染色和第28d的钙化结节染色和茜素红定量也说明10^-8～10^-5M的淫羊藿苷可促进hBMSCs向成骨方向分化。各试验均以10^-6M为最佳浓度,但是从整体上看,淫羊藿苷的成骨诱导能力不及rhBMP-2。10^-6M淫羊藿苷可促进成骨相关基因ALP、OCN、OPN、Col-Ⅰ、Cbfa1、BMP-2、BMP-4和BMP-7 mRNA的表达和成骨相关蛋白Cbfa1、OCN、BMPs的表达,与rhBMP-2具有协同作用。2.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的构建采用原位复合和冷冻干燥技术可构建出CS/HA复合材料,扫描电镜观察发现该材料表面具有均匀分散的200～700nm HA颗粒,XRD和FTIR分析表明合成的HA是含CO₃^2-弱结晶纳米晶体;该材料的孔隙率、孔径和密度分别为:88.70±2.27%、112.63±20.52μm和71.51±2.55 kg/m³;材料浸提液对细胞生长曲线无干扰,其表面接种的细胞亦可自由生长;肌袋埋植试验表明,8w后组织炎性反应消退,12w时CS/HA复合材料已基本降解,材料被纤维组织爬行替代。淫羊藿苷载药过程对CS/HA复合材料的理化性质无显著影响,对其力学性能的影响与载药剂量相关:10^-5和10^-6mol载药量降低了材料的弹性模量（与CS/HA比较,P＜0.05）;该材料细胞相容性良好,可诱导hBMSCs向成骨方向分化;溶血试验表明淫羊藿苷-CS/HA复合材料血液相容性良好,不会导致溶血;热原试验亦证明淫羊藿苷-CS/HA复合材料无热原性。3.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的体外释药行为超高效液相色谱（UPLC）的精密度试验和重现性试验的RSD分别为0.636%和3.245%;加样回收率试验的平均回收率为96.667%,RSD为2.139%;稳定性试验RSD为1.286%;在1～2000ng质量范围内,淫羊藿苷的色谱峰面积与进样量之间呈良好的线性关系,回归方程为:Y=7877.3X+202422,R²=0.9976。通过释药累积曲线可知,释药初期（0～3d）,药物从支架材料中爆发性地释放出来,约达载药量的25%,而后释药速度迅速下降,至第20d约有40%～60%左右的药物释出,之后以低速持续释放,90d后仍有部分药物存留于支架材料中。三种载药量的释药拟合方程分别为,载10^-7mol淫羊藿苷-CS/HA复合材料:Y=6.267+13.468 ln（X） R²=0.901;载10^-6mol淫羊藿苷-CS/HA复合材料:Y=5.668+16.846 ln（X）R²=0.916;载10^-5mol淫羊藿苷-CS/HA复合材料:Y=6.322+18.466 ln（X）R²=0.923,释药行为符合一级方程。4.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的体内成骨效能骨缺损模型组的各项检测结果表明:骨缺损部位自身修复能力低下,造模后两断端骨髓腔逐渐闭合,至12 w时髓腔完全封闭形成骨缺损。第4 w进行的ECT检测结果表明:4个材料植入组的ECT值均显著高于骨缺损模型组（P＜0.001）,载药量为10^-6mol和10^-5mol的淫羊藿苷-CS/HA组显著高于单纯CS/HA植入组（P＜0.01）;大体观察和X线检查结果表明,在第4w植入淫羊藿苷—CS/HA材料可观察到明显的骨痂桥接断端,植入8w后骨痂大量生长,骨缺损基本愈合,到12 w时髓腔再通,骨愈合进入塑形期。BMD检测结果:4个材料植入组的BMD值均显著高于骨缺损模型组（P＜0.001）,载药量为10^-6mol和10^-5mol的淫羊藿苷-CS/HA组显著高于单纯CS/HA植入组（P＜0.001）。从组织学切片的观察发现,淫羊藿苷-CS/HA植入骨缺损后,材料的降解速度随载药剂量的增加而明显加快,4 w时材料即发生明显的崩解、碎裂,其周围可见大量新生软骨形成并逐渐向材料的中央长入;8 w时材料进一步降解,被分割的材料间隙有大量软骨组织形成,部分发生骨化;至12 w时材料完全降解,软骨被骨组织替代,新生的骨组织排列紊乱,中央可见细小的骨髓腔结构,骨修复速度快于单纯应用CS/HA复合材料。结论1.淫羊藿苷可促进hBMSCs的增殖和成骨分化,这两种作用与淫羊藿苷的浓度相关;淫羊藿苷诱导成骨效能逊于rhBMP-2。2.淫羊藿苷可诱导hBMSCs成骨相关基因和蛋白的表达,与rhBMP-2具有协同作用。3.采用原位复合和冷冻干燥方法可制备出CS/HA复合材料,该材料具有良好的孔隙率和生物相容性,化学构成与天然骨近似。4.淫羊藿苷载药过程对CS/HA复合材料的理化性质无显著影响,对其力学性能的影响与载药剂量相关;载药过程不会影响CS/HA复合材料的生物相容性。5.淫羊藿苷-CS/HA复合材料在体外释药缓慢,释放时间可达90d以上,释药行为遵循一级方程。6.淫羊藿苷-CS/HA复合材料具有骨传导性和骨诱导活性,可促进原位骨再生。