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目的:结直肠癌属中医癥瘕的范畴。其病机为“正气亏虚,毒瘀内结”。具有扶正活血解毒法的芪贞汤对该病疗效确切,但对于芪贞汤治疗CRC的机制尚不明确。课题组前期对于芪贞汤的研究发现,用芪贞汤灌胃对结直肠癌（colorectal cancer,CRC）模型小鼠治疗有明显的疗效,并能够显著提高小鼠肠道中嗜黏蛋白艾克曼菌（Akkermansia muciniphila,AKK菌）丰度。查阅文献发现AKK菌可诱导树突细胞（dendritic cells,DC）成熟并使其释放IL-12,继而通过IL-12/JAK-STAT通路发挥抗肿瘤的作用。因此,本研究建立体内外模型研究芪贞汤联合AKK菌,诱导DC细胞成熟分泌IL-12等细胞因子,进而发挥抗肿瘤的作用和分子机制,为中医药治疗CRC和菌群辅助治疗的临床使用提供新的实验依据。方法:1.从扶正的角度探讨结直肠癌的病因病机:通过查阅古典及现代关于结直肠癌的相关文献,整理中医对结直肠癌的认识,从正气亏虚以及其病理产物方向探讨治疗结直癌的方法。2.AKK菌的培养与鉴定:采用改良的BHI细菌培养基培养AKK菌,活化后提取AKK菌的基因组DNA,扩增其16S r DNA片段,在Gen Bank中对比,使用MEGA6.0软件分析已培养的AKK菌的序列进化树,获取鉴定结果。为后续芪贞汤联合AKK菌实验中所需的菌液浓度,绘制其生长曲线以确定对数期。3.CRC小鼠模型构建:在一定周期内,使用国际通用致癌剂氧化偶氮甲烷（AOM）与葡聚糖硫酸钠（DSS）联合法进行造模,造模后使用结直肠组织的病理结果作为评价指标。4.体内实验研究AKK菌对CRC小鼠的治疗作用及机制:观察AKK菌干预组（AKK）、AKK菌+巨噬细胞清除剂干预组（AKK+CL）、巨噬细胞清除剂干预组（CL）、CRC无菌小鼠模型对照组（Model）、无菌小鼠空白组（Control）中CRC小鼠的一般状态、结直肠长短及肿瘤个数,并采用HE染色法观察结肠组织的病理情况;酶联免疫吸附剂测定技术（ELISA）测定CRC小鼠中芪贞汤联合AKK菌对炎症因子IL-12、IL-18和IFN-γ的影响;免疫荧光法定位组织中CD80、CD86、CD11C的分布情况;流式细胞术法检测CRC小鼠脾脏DC细胞的表型,观察细胞成熟情况。5.体内实验研究芪贞汤联合AKK菌对CRC小鼠的治疗作用及机制:观察无菌小鼠空白对照（Control）、AKK菌干预组（A）、芪贞汤+AKK菌干预组（A+K+Y）、芪贞汤+AKK菌+抗生素干预组（A+K+W）、CRC无菌小鼠模型对照组（Model）中CRC小鼠的病理情况以及其炎症因子和DC细胞的分布。6.体外实验研究AKK菌对DC细胞的调控作用:建立AKK菌与DC细胞共培养体系,通过姬姆萨染色法计算DC细胞吞噬比率,并通过电镜、ELISA、免疫荧光法等方法观察AKK菌对imDC细胞成熟的促进作用。结果:1.AKK菌的培养条件确定及菌种鉴定经过对AKK菌的培养、形态学及分子生物学鉴定,结果表明其与AKK菌属菌种的相似性较高为98.3%,确认为AKK菌,其对数期为第3-4天,可用于后续体内外实验研究。2.对CRC小鼠模型建立的评估与正常小鼠相比,模型组CRC小鼠的饮食量下降,精神活动状态明显降低,皮毛光泽度下降,体重明显降低并伴有血便;所有CRC模型组小鼠的结直肠中均见瘤体形成,分布广泛、病理改变明显,并且出现结直肠的长度缩短情况;在病理方面,模型组的小鼠,其细胞表现为明显异型性改变,层次增多,极像和腺管结构显现紊乱,部分腺体呈现融合,黏膜层表现出异型,表现为较大范围的炎细胞侵袭。3.AKK菌调节CRC小鼠免疫炎症因子及抗肿瘤的作用3.1小鼠状态及体质量的改变:CRC模型组小鼠在给药期间表现出精神萎靡,食欲下降,毛发暗淡无光,部分小鼠出现便血,易扎堆蜷缩;AKK菌干预的小鼠表现活跃,饮食、饮水量增加,便血减少,体重增加;CL组小鼠体重减轻,存在便稀、便血症状。3.2关于CRC无菌小鼠结肠长度及成瘤情况的改变:与空白组小鼠相比,无菌小鼠模型组的结肠组织长度明显缩短,统计分析有显著差异（p<0.01）;与模型组相比,加入AKK菌后结直肠长度明显增加,统计分析有极显著差异（p<0.01）;AKK菌组与AKK+CL组相比,结肠长度变化不明显,统计分析组间无显著差异（p>0.05）;与CL组相比,加入AKK菌后,小鼠结肠长度显著增长,统计分析有极显著差异（p<0.01）。成瘤情况的影响:与Model组相比,AKK组和AKK+CL组小鼠肿瘤个数明显减少,统计学分析有显著性差异（p<0.01）;AKK组和AKK+CL组组间在减少肿瘤数量上未见统计差异（p>0.05）。HE染色:可见AKK干预组小鼠的肠黏膜结构趋于正常,增生程度较低,腺管和极像结构出现轻微紊乱和融合现象;AKK加巨噬细胞清除剂组小鼠肠黏膜结构增生程度较正常组程度加深;单纯巨噬细胞小鼠的肠黏膜结构破坏明显,肿瘤组织浸润肠壁肌层,细胞出现异型性改变。3.3 ELISA实验结果显示AKK菌干预CRC小鼠后IL-12、IL-18、IFN-γ的表达水平,其中加入AKK菌干预后,各组别均有显著差异（p<0.05）。3.4流式细胞术显示嗜黏蛋白艾克曼菌干预CRC小鼠后,CRC无菌小鼠模型组CD80、CD86显著降低（p<0.01）;加入AKK菌干预后,CD80、CD86淋巴细胞含量显著增加（p<0.01）;与巨噬细胞清除剂组相比,模型组无显著性差异（p>0.05）,但加入AKK后,CD80、CD86淋巴细胞含量增加（p<0.05）。因此,对于自身免疫监控和免疫应答,加入AKK菌能有效改变小鼠脾细胞中CD80、CD86等淋巴细胞含量,发挥重要作用。3.5免疫荧光法显示CD11c分别于CD80和CD86双染情况下观察发现,空白对照组CD80表达明显优于模型组,予以AKK治疗后,CD80和CD86表达明显优于模型组和巨噬细胞清除剂组。4.芪贞汤联合嗜黏蛋白艾克曼菌调节CRC小鼠免疫炎症因子及抗肿瘤的作用4.1小鼠状态及体质量的改变:模型组小鼠在整个治疗期体重减轻但不稳定,最后一个给药周期体重下降明显;AKK组小鼠体重增加平稳,且加入芪贞汤后,小鼠体重增加明显,但总体体重较空白组略有不及。4.2芪贞汤联合AKK菌对小鼠结肠长度的改变:教空白组小鼠来说,CRC无菌小鼠模型组结肠组织长度明显缩短,统计分析有显著差异（p<0.01）;与CRC无菌小鼠模型组相比,加入嗜黏蛋白艾克曼菌后结肠长度明显增长,统计分析有极显著差异（p<0.01）;而A+K+W组小鼠结直肠与AKK组相比,统计分析组间无显著差异（p>0.05）,与A+K+Y组相比,长度增加,统计分析有显著差异（p<0.05）。4.3 ELISA实验结果显示作用于CRC小鼠后IL-18、IFN-γ的表达水平,其中芪贞汤干预AKK菌组与空白对照组比较差异具有极显著意义（p<0.01）;IL-12表达具有显著意义（p<0.05）。4.4流式细胞术显示嗜黏蛋白艾克曼菌干预CRC小鼠后模型组CD80、CD86显著降低（p<0.01）;与模型组相比,而加入芪贞汤及AKK干预后,CD80、CD86淋巴细胞含量显著增加（p<0.01）;4.5免疫荧光法显示CD11c分别于CD80和CD86双染情况下观察发现,空白对照组CD80、CD86表达明显优于模型组;予以芪贞汤加AKK治疗后,CD80、CD86表达明显优于模型组和AKK组,与芪贞汤干预的有菌小鼠相比;加入抗生素干预后,无菌小鼠CD80、CD86成熟增多。5.AKK菌促进imDC成熟,发挥抗肿瘤作用AKK菌可以被imDC吞噬,且能促进细胞成熟并使其分泌IL-12。电镜下观察AKK菌干预的imDC体积变大,长出伪足,伸出许多树突样突起;免疫荧光法观察AKK菌作用于imDC后,细胞中CD80、CD86的表达均明显提高;AKK感染后的DC细胞24、48和72 h后,含有嗜黏蛋白艾克曼菌的上清液中IL-12均明显高于正常组imDC（p<0.01）,而AKK感染的的imDC在24、48和72 h分泌的IL-12与LPS干预的DC分泌的IL-12,差别无统计学意义（p>0.05）;表明AKK菌株可促进DC细胞IL-12的分泌,且感染AKK后,DC细胞分泌IL-12的水平与LPS干预无显著性差异,显示AKK菌可以促进imDC成熟,分泌IL-12发挥抗肿瘤作用。结论:1.通过改良BHI培养基,活化并培养出AKK菌,经过16S r DNA鉴定为Akkermansia muciniphila菌属,成功培育出AKK菌,为后续体内外实验做准备。2.芪贞汤联合AKK菌可以明显改善CRC小鼠的体重及一般状态,增加结肠长度,减少肿瘤个数,改善CRC模型小鼠结肠组织结构及非典型增生程度。3.芪贞汤抗CRC的作用机制可能是通过联合AKK菌诱导imDC细胞成熟,使其体积变大,伸出许多树突样突起并释放IL-12,进而激活IL-12/JAK-STAT通路发挥抗肿瘤的作用。