江香薷多糖和两种阿拉伯胶的结构解析及功能特性

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江香薷主要分布于江西省,是江西的特产资源,属于唇形科,在民间是一种药食两用的植物。目前已有部分关于其挥发油、黄酮类化合物的报道,但有关江香薷多糖的结构和活性目前国内外还处于空白。本文系统地研究了江香薷中多糖的提取、分离纯化、理化性质、一级结构、抗氧化、免疫调节作用等生物活性。研究结果可为江香薷的药理作用研究提供理论基础,并为江香薷的开发和利用提供实验数据和理论依据。论文第二部分主要研究了阿拉伯胶(Acaica senegal)和赛伊尔相思树胶(Acacia seyal)经过7小时部分水解产物的一级结构(单糖组成、糖残基连接方式及顺序),并通过美拉德反应改善其乳化性,从而提高它们的商业价值,拓展其应用空间。本文主要研究内容与结论如下:1.在单因素实验基础上,采用响应曲面法(RSM)对影响江香薷粗多糖提取率的三个主要因素:提取温度、提取时间和液固比进行优化。结果表明:提取温度86.9℃、提取时间4.10h、液固比17.7:1(mL/g),江香薷粗多糖提取率的预测值为3.38%,与实测值3.41%基本相符。粗多糖经过Sevag法脱除蛋白,得到江香薷精制多糖(MP)。MP先后经过DEAE-52纤维素色谱柱和SephacrylTMS-400HR凝胶层析柱分离得到一个中性纯多糖MP-1。当MP使用Q SepharoseTMFast Flow阴离子交换色谱进行分离,用1M NaCl进行洗脱,将其中得率较高的一个组分采用乙醇分级沉淀法进行分离,当乙醇浓度为40%(v/v)时,得到一种酸性纯多糖MP-A40。2.江香薷粗多糖CMP,精制多糖MP,中性纯多糖MP-1和酸性纯多糖MP-A40的中性糖含量分别为37.84±0.04%,33.96±0.31%,71.86±0.22%,10.30±0.04%;糖醛酸含量分别为5.18±0.16%,11.00±0.24%,0%,68.63±0.06%;蛋白质含量分别为6.14±0.01%,9.05±0.04%,1.96±0.08%,0.17±0.00%。气相色谱法分析CMP的单糖组成分别为鼠李糖,核糖,岩藻糖,阿拉伯糖,木糖,甘露糖,葡萄糖和半乳糖,摩尔比为3.72:2.45:0.92:6.00:2.76:5.09:13.53:9.58;MP的单糖组成分别为鼠李糖,阿拉伯糖,木糖,甘露糖,葡萄糖,半乳糖,摩尔比分别为5.364:12.260:3.448:12.260:32.567:30.651;MP-1单糖组成为葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖,摩尔比为16.02:10.01:4.92:4.62:2.23,以及痕量岩藻糖。MP-A40的单糖组成使用离子色谱法检测,其中性糖包括阿拉伯糖(4.94%),半乳糖(3.07%),鼠李糖(2.13%),甘露糖(1.62%)及葡萄糖(1.29%),以及68.63%的半乳糖醛酸。MP包含四个组分,分子量分别为4522723Da,254918Da,127350Da和18664Da,而MP-1和MP-A40的分子量分别为587530Da和32600Da。经过HPSEC法鉴定,MP-1和MP-A40均为均一纯多糖。3. MP-1经过甲基化分析确定其糖残基间的连接方式包括→4-Glcp1→(31.76%),→2-Rhap1→(17.11%),t-Galp1→(11.02%),→2,4-Rhap1→(6.47%),→3,4-Galp1→(5.05%),t-Rhap1→(4.31%),t-Glcp1→(4.04%),t-Araf1→(4.01%),→4-Manp1→(3.61%),→5-Araf1→(3.10%),→3-Galp1→(3.05%),→2,4-Manp1→(2.55%),t-Fucp1→(2.39%)和→4,6-Glcp1→(1.53%)。根据糖残基比例判断其主链由→4-Glcp1→,→2-Rhap1→,→2,4-Rhap1→构成,末端主要为t-Galp1→。4.通过甲基化和1D/2D NMR分析,MP-A40的一级结构重复单元为→4)-[α-GalpA6Me-(1→]m-[4-α-GalpA-(1→]n。红外光谱法分析MP-A40酯化度约为32%。5.本章研究了中性纯多糖MP-1和酸性纯多糖MP-A40的体外抗氧化作用。通过DPPH自由基清除实验,铁离子还原能力,还原力实验和胡萝卜素-亚油酸体系四个抗氧化体系,证明江香薷多糖具有一定的抗氧化性,而且MP-A40的抗氧化性优于MP-1。6.使用化疗药物环磷酰胺(CY)诱导构建小鼠免疫抑制模型,以江香薷精制多糖灌胃小鼠,考察小鼠肝脏、心脏和肾脏中各种抗氧化酶活性的恢复情况。小鼠肝脏、心脏和肾脏分别用0.1g/mL的冰生理盐水研磨成匀浆,以3000rpm的速度,4℃下离心10min,取上清液分别检测总抗氧化(T-AOC),丙二醛(MAD),过氧化氢酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等参数。结果证明MP不仅提高了脾脏指数和胸腺指数,而且显著提高了T-AOC,CAT,SOD和GSH-PX的酶活,降低了MDA的水平。因此,精制多糖(MP)可以降低环磷酰胺引起的的小鼠免疫抑制作用,在免疫系统防止抗氧化损伤过程中扮演重要的角色。7.粗多糖CMP刺激原代巨噬细胞吞噬中性红的实验结果表明,随着多糖浓度的增加,巨噬细胞对中性红的吞噬作用也增强。CMP刺激原代小鼠腹腔巨噬细胞产生NO,也随多糖浓度的增加而增加,并呈剂量依赖关系。脾淋巴细胞增殖实验表明MP-1可以显著促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖,而且对T淋巴细胞增殖更有效。当MP-A40浓度为500μg/mL时,K562的抑制率为31.32%。MP-A40浓度为10μg/mL时,NO的产量是阴性组的15倍。当多糖浓度从200μg/mL增至500μg/mL,NO产量从32.58μM显著增加至35.02μM。结果证明MP-A40对促进RAW264.7产生NO具有显著作用。8.将2g阿拉伯胶Acacia seyal和Acacia senegal分别溶于200mL0.1MTFA,于100℃水解7h,比较两种阿拉伯胶部分酸水解产物的一级结构信息。通过甲基化分析,得出seyal-7中各糖基的连接方式及比例分别为t-Galp(13.76%),→3-Galp1→(9.70%),→4-GalpA1→(13.70%),→6-Galp1→(30.98%),→4,6-Galp1→(1.63%),→3,6-Galp1→(27.54%),→3,4,6-Galp1→(1.40%),→2,3,6-Galp1→(1.27%);senegal-7中各糖基的连接方式及比例分别为t-Galp(11.65%),→3-Galp1→(12.41%),→6-Galp1→(33.85%),→3,4-Galp1→(1.34%)→4,6-Galp1→(1.75%),→3,6-Galp1→(34.61%),→2,6-Galp1→(1.14%),→2,3,6-Galp1→(3.24%)。再经过1D/2D NMR(1H,13C,COSY,TOCSY,HSQC,HMBC,NOESY)对seyal-7糖残基的连接顺序进行分析,得出重复单元的结构信息,最终判断其主链结构为→1,6-Galp1→,并且在O-2,O-3,O-4三个位置有连接位点。9.将两种阿拉伯胶Acacia seyal和Acacia senegal置于60℃,湿度为75%(饱和盐水提供)的密闭环境中,样品发生美拉德反应。结果表明,反应时间为7天时,乳化液的(10%菜籽油,v/v)粒径最小,稳定性最好。
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