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第一部分Dnmt3a通过影响IRF3磷酸化促进TLR和RIG-Ⅰ诱导的Ⅰ型干扰素的产生巨噬细胞作为天然免疫的重要组成部分发挥着重要的免疫防御功能。在巨噬细胞发育、分化的不同阶段,转录因子和靶基因表达谱和表达水平均发生着改变。那么在此过程中,表观调控机制究竟起到了什么样的作用呢?Dnmt3a作为DNA甲基化转移酶,它可以对基因组中的CpG岛中的C进行从头甲基化。在胚胎发育的不同阶段、细胞的不同分化阶段及不同组织的肿瘤细胞中,Dnmt3a则可以选择性的引起不同靶基因甲基化状态的改变,从而发挥对靶基因的表观调控。为了探讨Dnmt3a在腹腔巨噬细胞中的作用,我们首先在腹腔巨噬细胞中利用RNA干扰技术下调内源性Dnmt3a的表达,通过RT-qPCR和ELISA的方法检测腹腔巨噬细胞产生细胞因子的mRNA和蛋白水平,发现在腹腔巨噬细胞中干扰Dnmt3a可以选择性地抑制TLR和RIG-Ⅰ诱导的Ⅰ型干扰素的产生。我们获得了巨噬细胞Dnmt3a条件性敲除小鼠,通过细胞计数和FACS的方法对Dnmt3a条件性敲除小鼠来源的腹腔巨噬细胞进行了表型分析,发现Dnmt3a条件性敲除小鼠来源的腹腔巨噬细胞数目及表面标志表达比例和程度无明显差异,但是,在TLR配体刺激和VSV病毒感染下,来源于Dnmt3a条件性敲除小鼠的腹腔巨噬细胞Ⅰ型干扰素产生能力显著减弱。通过Western blot技术,我们筛查了Ⅰ型干扰素诱导产生的信号通路,发现干扰Dnmt3a的表达或条件性敲除Dnmt3a能够抑制IRF3磷酸化。我们建立了Dnmt3a条件性敲除小鼠的VSV感染模型,发现Dnmt3a条件性敲除小鼠抗病毒感染能力减弱,表现在死亡率增加,血清中IFNβ水平减低,肝、脾、肺脏组织中VSV病毒的复制能力和滴度明显增加。综上所述,本部分研究结果提示Dnmt3a可能是通过影响IRF3磷酸化而促进Ⅰ型干扰素的产生的。第二部分Dnmt3a通过HDAC9介导的TBKl去乙酰化以促进Ⅰ型干扰素的产生组蛋白去乙酰化酶在炎症和免疫反应中发挥重要的调控作用。多种组蛋白去乙酰化酶参与了TLR配体诱导的细胞因子产生和Ⅰ型干扰素及IFNγ下游信号通路的各个环节。HDAC9属于Ⅱa类组蛋白去乙酰化酶,因其C末端含有核输出信号主要定位于胞浆中,并且可在胞浆和胞核间穿梭。为了探讨Dnmt3a作为核定位分子调控胞浆信号通路分子IRF3磷酸化的机制,我们首先利用RNA芯片技术对干扰内源性Dnmt3a表达的腹腔巨噬细胞进行表达谱检测,发现干扰Dnmt3a的表达能够抑制HDAC9的表达。并且我们又通过RT-qPCR和Western blot技术对芯片结果进行了验证。通过Confocal技术对腹腔巨噬细胞中内源性的和293T细胞中过表达的HDAC9的亚细胞定位进行分析,发现在腹腔巨噬细胞中HDAC9主要定位于胞浆。在腹腔巨噬细胞中利用RNA干扰技术下调内源性HDAC9的表达,通过RT-qPCR和Western blot技术检测腹腔巨噬细胞中HDAC9的mRNA和蛋白水平表达以及细胞因子产生水平和IRF3磷酸化,发现在腹腔巨噬细胞中干扰HDAC9可以降低IRF3磷酸化水平,抑制TLR和RIG-Ⅰ诱导的Ⅰ型干扰素的产生。通过免疫共沉淀和Western blot技术,发现HDAC9通过其去乙酰化结构域与TBK1相互作用,TBK1的C末端即ULD和CC结构域在HDAC9和TBK1的相互作用中发挥重要作用,TBK1存在乙酰化修饰,并且TBK1的乙酰化状态可以抑制其自身的激酶活性。通过体外激酶实验和Western blot技术,发现HDAC9可以通过对TBK1的去乙酰化促进其激酶活性。通过IP-MS技术,我们进一步鉴定了TBK1的赖氨酸乙酰化修饰位点。综上所述,本部分研究结果提示Dnmt3a可能是通过HDAC9介导的TBK1去乙酰化进而促进Ⅰ型干扰素的产生的。第三部分Dnmt3a通过影响HDAC9远端启动子区H3K27me3水平以调控HDAC9的表达目前关于DNA甲基化与基因表达的关系存在两种观点,传统观点认为大多数近端启动子CpG富集区域(CpG岛)的DNA甲基化与基因沉默相关。但是新近的报道提示依赖于Dnmt3a的非近端启动子区DNA甲基化亦可以通过拮抗染色质重塑蛋白多聚梳的抑制作用来维持基因的染色质活化状态促进基因表达。那么为了进一步探讨Dnmt3a促进HDAC9表达的机制,我们在Dnmt3a干扰或敲除的腹腔巨噬细胞中通过ChIP实验发现Dnmt3a能够结合在HDAC9启动子区。通过Me-DIP技术,我们发现在Dnmt3a敲除的腹腔巨噬细胞中,HDAC9远端启动子区的DNA甲基化水平降低。通过ChIP实验,发现在Dnmt3a干扰或敲除的腹腔巨噬细胞中HDAC9远端启动子区H3K27me3的水平增加。综上所述,本部分研究结果提示Dnmt3a通过其DNA甲基化能力拮抗HDAC9远端启动子区H3K27me3水平以调控HDAC9的表达,进而通过HDAC9介导的TBK1去乙酰化促进了Ⅰ型干扰素产生和抗病毒天然免疫应答反应。