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谷草转氨酶(Glutamate oxaloacetate transaminase, GOT)主要催化L-天冬氨酸和α-酮戊二酸生成L-谷氨酸与草酰乙酸的可逆反应,在生物体内的碳和氮的代谢中扮演着重要角色。谷草转氨酶作为依赖磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5’-phosphate-dependent, PLP)的酶类,在人体内存在于细胞质和线粒体中,分别称之为GOT1和GOT2。GOT1被证明是维持胰腺癌细胞氧化还原平衡和癌细胞生长所需的谷氨酰胺碳骨架代谢中的关键物质,因此GOT1是抗肿瘤药物的分子靶标,解析GOT1的结构将有助于设计,选择抑制癌细胞生长的药物。(1)GOT1的高纯度重组表达与性质分析通过构建表达载体pET22b-gotl,重组酶在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了可溶性表达。通过HisTrapTM FF crude column柱层析和HiTrapTM Q XL阴离子交换柱层析分离纯化得到了高纯度蛋白。蛋白比活力为70.83 U/mg,纯化倍数为133.6倍,活力回收率为18.3%。凝胶排阻色谱表明重组GOT1的聚集形式为二聚体,所形成的二聚体的分子量为66 kDa。该酶的最适温度为37℃,最适pH 7.5。在35～45℃,及碱性条件下(pH7.5-10.0),酶的稳定性较好。纯化后的GOT1被Na+、F和Mg2+金属离子轻微的抑制,被Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+和Ca2+金属离子显著抑制。(2)GOT1的结晶条件筛选及晶体数据解析初始筛选目的蛋白GOT1的晶体的蛋白浓度为5 mg/ml,并确定了三个初筛的条件,分别是Crystal Screen试剂盒的No.9 (0.2 M ammonium acetate,0.1 M Na citrate tribasic dihydrate pH 5.6,30% w/v Polyethylene glycol 4000), Index试剂盒的No.42 (0.1 M BIS-Tris pH5.5,20% w/v PEG 3350), Index试剂盒No.43 (0.1 M BIS-TrispH 6.5,25% w/v PEG 3350)。经过条件优化,最终确定重组GOT1的结晶最佳条件为0.1 M BIS-Tris pH 6.0,21% w/v PEG 3350。GOT1勺晶体(PDB登录号：3WZF)通过气相扩散悬滴法获得,结构数据利用X-射线衍射收集。解析后的晶体分辨率为2.99 A,晶体属于空间群P43212,晶胞参数为a=93.4A,b=93.4 A, c= 107.4A, α=β=γ=90°。(3)谷草转氨酶的生物信息学分析虽然二种人来源的细胞质谷草转氨酶在表达载体及结晶条件上采用的方法不同,但二者整体序列的相似度上达95%。晶体3110的100%的残基位于合理允许区域,而晶体3WZF的98.5%的残基位于合理允许区域,其中有6个残基其φ-Ψ,角出现异常。GOT1和GOT2二者在氨基酸序列上的相似性不到50%,但在三级结构上二者相似度很高。GOT1的活性口袋的关键氨基酸为Gly 39, Trp 141, Asn195, Arg 387,而GOT2的关键氨基酸为Gly 65, Trp 162, Asn 215, Arg 407。二者催化的活性氨基酸相同,但位置不同。通过进化树分析发现,GOTl与猪来源的、鸡来源的谷草转氨酶在进化上序列较为相似。分子对接分析表明,PLP与GOT1发生了较强的相互所用。底物氨基酸如Asp, Cys及Glu可以与关键氨基酸形成3A以内的氢键,并与该酶产生紧密的结合。