论文部分内容阅读
杆状病毒(baculovirus)是具有高度宿主特异性的一类节肢动物病毒。家蚕杆状病毒于1999年完成测序,部分基因功能已经报道,但仍然有很多基因功能没有注释。因此,本论文选择了家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)ORF134和ORF51两个功能未知的杆状病毒基因为研究对象,对基因转录、表达、亚细胞定位、病毒结构定位、基因缺失进行了分析,为进一步解析杆状病毒的分子生物学理论奠定基础。论文主要结论如下:1.BmORF134基因位于BmNPV(T3株)基因组127342-127671nt,全长330bp,编码一个含109个氨基酸残基的蛋白,预测分子量约为12.4kDa,在Bm134基因ATG上游43nt有杆状病毒晚期转录基序GTAAG;氨基酸序列同源性比较发现,Bm134与NPⅥ型AcMNPV ORF5的同源性高达93%,与其它12种杆状病毒同源性亦非常高。BmORF51基因位于BmNPV(T3株)基因组45935-46402nt,全长468bp,编码一个含155个氨基酸残基的蛋白,预测分子量约为18.5kDa,在Bm51基因ATG上游26nt有杆状病毒早期转录基序CAGT,在CAGT序列的上游31nt有一个TATA框;此外,在Bm51基因TAA下游454nt有一个典型的加A信号AATAAA。2.根据BmORF134基因序列设计引物,以BmNPV基因组DNA为模板进行PCR扩增,将得到的基因克隆至原核表达载体pET30a(+),在原核细胞中实现了基因的融合表达。纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备了BmORF134蛋白的多克隆抗体。抗体与BmNPV感染的BmN细胞总蛋白进行的杂交,显示一条12.4 kDa的特异杂交带,该蛋白带与推测的大小一致。RT-PCR分析结果表明,BmORF134基因在病毒感染细胞中的转录均从12 h开始就可以检测到,一直持续到感染后72 h。BmORF134蛋白的表达是从感染后24 h才开始检测到。利用Western blot方法检测分离出的BV、ODV粒子表明,BmORF134是病毒粒子ODV相关的结构蛋白。免疫杂交后用免疫荧光共聚焦显微镜进行观察,可见荧光在24 h时主要集中在细胞质中,随后在48 h和72 h在细胞核中被检测到。3.PCR扩增Bm51全长基因,采用pET30a(+)载体在大肠杆菌中进行了融合表达。通过对Bm51基因在大肠杆菌中的融合表达发现Bm51蛋白在大肠杆菌系统中能够良好地表达,表达的融合蛋白分子量约为24.5kD,正好是18.5kDa的Bm51与6 kDa的His标签之和。Western blotting进一步证实了pET30a-Bm51在大肠杆菌BL21中表达的重组蛋白确实为His-Bm51融合蛋白。蛋白纯化后制备了BmORF51蛋白的多克隆抗体。通过QRT-PCR和Westernblotting分析了Bm51在家蚕NPV抗性品种(NB)和NPV感性品种(306)的转录和表达时相,结果表明Bm51基因在病毒感染NB后6小时被检测到,于36 h p.i.达到最大值,然后逐渐减少,到72 h p.i.消失,而在病毒感染的306中Bm51蛋白的表达从被检测到开始,到72 h p.i.间一直持续增长。从这一结果可以得出NB中的一些宿主因素抑制病毒早期基因的表达。4.利用Red重组系统在大肠杆菌DH10B中成功地对BmNPV的Bm134基因进行了快速定点敲除,并同时在该位点插入了氯霉素基因Cm。再将BmNPV/Bac-to-Bac系统和Red重组系统结合在一起,对敲除了Bm134基因的BmNPV进行了拯救,分别构建了野生型病毒vBm134-Wt,Bm134基因缺失病毒vBm134-Ko和Bm134基因拯救病毒vBm134-Re。再将经过转座带有绿色荧光蛋白基因(green flucrescence protein,gfp)和多角体基因(polh)的重组Bacmid转染BmN细胞,荧光观察显示三种病毒在感染细胞后都有荧光,说明敲除Bm134基因对病毒的复制影响甚微。