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目的1、探索Aurora A与多发性骨髓瘤细胞(Multiple myeloma,MM)对硼替佐米(Bortezomib,BTZ)耐药的相关性。2、研究Aurora A通过蛋白质翻译后修饰组蛋白甲基转移酶(Nuclear Receptor Binding SET Domain Protein 2,NSD2)促进MM对BTZ耐药性产生的机制。3、评估靶向Aurora A对逆转MM对BTZ耐药和骨破坏的效果。方法利用含有181个靶向明确小分子抑制剂的表观遗传库,梯度浓度抑制剂联合BTZ处理MM 48小时后筛选出对于抗MM与BTZ具有协同作用的小分子抑制剂。通过细胞活性检测和流式检测比较Aurora A选择性抑制剂(MLN8237)对不同遗传背景MM细胞的杀伤作用。通过Western blot和Real-time PCR探究Aurora A与NSD2表达的相关性,Western blot、蛋白免疫共沉淀和质谱分析探究Aurora A和NSD2相互作用。通过动物实验建立小鼠移植瘤和骨破坏模型,探究Aurora A抑制剂MLN8237协同BTZ抗MM细胞的效果,为临床应用Aurora A抑制剂联合BTZ治疗复发性和难治性MM病人提供理论依据。结果1.BTZ联合含181靶向明确的小分子抑制剂的表观遗传库处理LP-1,用CCK8检测后通过Clasyne计算发现Aurora A选择性抑制剂MLN8237能协同BTZ杀伤t(4;14)的LP-1,同时MLN8237效果明显高于激酶家族内其他成员抑制剂。当MLN8237作用于非t(4;14)的多发性骨髓瘤细胞(MM.1S)时,发现效果远不如LP-1。因此Aurora A选择性抑制剂(MLN8237)和BTZ能够协同抗MM并且对于t(4;14)MM该效果更强。2.NSD2和Aurora A的表达量正相关。FISH结果验证LP-1属t(4;14)染色体易位的MM细胞,而MM.1S不属于该突变类型。t(4;14)染色体突变导致NSD2基因置于Ig H基因增强子下游并高表达。Western blot以及Real-time PCR实验表明无论在蛋白水平上还是m RNA水平上NSD2和Aurora A在LP-1表达量均高于MM.1S。3.Aurora A促进NSD2稳定性。在MM细胞中过表达或使用MLN8237抑制Aurora A活性时发现Aurora A的表达与NSD2的蛋白水平及功能正相关;MLN8237促进p CMV3-NSD2-FLAG质粒过表达的HEK-293T产生一条长约70k Da的NSD2剪切条带产生;半衰期实验也表明当MLN8237作用于MM细胞时,NSD2半衰期明显缩短。4.Aurora A能够诱导NSD2磷酸化。免疫共沉淀结果确证Aurora A和NSD2存在相互作用;质谱分析发现Aurora A能够诱导NSD2磷酸化。5.Aurora A通过增强NSD2介导的转录激活功能促进MM细胞对BTZ的耐药。Western blot和Real-time PCR检测野生细胞和BTZ耐药细胞发现耐药细胞Aurora A和NSD2均上调;IC50实验结果发现Aurora A能够增强多发性骨髓瘤细胞对BTZ的耐受;通过Real-time PCR发现BTZ耐药相关基因在Aurora A-KD和NSD2-KD的MM细胞中均下调。6.Aurora A选择性抑制剂(MLN8237)和BTZ协同抑制小鼠移植瘤和骨破坏模型进展。使用NSG老鼠建立移植瘤和骨破坏模型,结果显示在LP-1组中,相较于单独用药组和对照组,BTZ和MLN8237联用组肿瘤的生长速度明显得到抑制,总体生存率显著延长,骨破坏程度和面积显著降低而MM.1S组效果则不明显。结论1、Aurora A抑制剂能够在体内外水平协同BTZ发挥抗MM的作用,并且该效果对于t(4;14)遗传背景的MM细胞更明显。2、Aurora A能够诱导NSD2磷酸化从而抑制其降解,同时促进H3K36me2水平上调从而促进BTZ耐药相关基因转录激活来促进MM对BTZ耐药。