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研究目的牙龈间充质干细胞(Gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)是一种易于获取、体外培养增殖能力强以及具有多向分化能力的干细胞,可通过各种免疫调节特性发挥生物治疗作用。巨噬细胞(Macrophages,Mφ)是炎症修复中的免疫明星细胞,在抗炎和组织修复过程中起重要作用。根据不同微环境信号,巨噬细胞可以分化成两种类型,即促炎性M1巨噬细胞(M1 Mφ)和抗炎性M2巨噬细胞(M2 Mφ)。本实验目的通过比较不同来源的人巨噬细胞生物学特征,选择最合适的巨噬细胞极化方案,研究了GMSCs对氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的人炎性巨噬细胞极化的影响,希望为GMSCs治疗高脂血症牙周病的临床应用提供理论依据和新思路。实验方法1、利用密度梯度离心法和磁珠分离法从人静脉血中获得高纯度的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的诱导下获得PBMC Mφ;用佛波酯(PMA)诱导人单核细胞系THP-1分化形成THP-1 Mφ;两组Mφ再分别向M1和M2两种极化类型诱导分化。在高倍镜下观察细胞形态变化和粘附情况;通过流式细胞术和PCR检测细胞内M1和M2型相关极化标记表达;通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量培养上清液的细胞因子分泌水平变化。2、收集因阻生齿或正畸治疗而拔牙过程中废弃的健康牙龈结缔组织,采用酶消化法分离培养获得GMSCs;经过细胞集落形成实验、成骨/成脂诱导分化实验和流式细胞术分析牙龈细胞的干细胞特征;通过Transwell小室建立M1 Mφ和GMSCs非接触式共培养模型,并用ox-LDL刺激24 h。显微镜下观察细胞状态,通过ELISA检测收集上清液的细胞因子分泌变化,用流式细胞术和PCR分析巨噬细胞中M1和M2相关极化标记表达,通过油红O染色并定量分析细胞内脂滴变化。实验结果1、两组悬浮细胞牢固粘附后,观察到典型的Mφ形态;PCR和流式细胞术结果显示,两种Mφ均在M1极化因子(LPS/IFN-γ)诱导后,TNF-α和IL-1β的mRNA水平显著上调(P<0.05),CD86的表达明显增加(P<0.05)。在M2极化因子(IL-4)诱导后,MRC1和IL-10 mRNA水平上调(P<0.05);CD206在PBMC Mφ中表达显著增强(P<0.05),而在THP-1 Mφ中没有差异(P>0.05)。ELISA结果显示,在M1极化诱导后,THP-1 Mφ的培养液中IL-1β和TNF-α分泌水平比PBMC Mφ更高(P<0.05)。2、通过酶消化法可以有效获取GMSCs。流式细胞仪检测P4代细胞表面干细胞标志物发现GMSCs阳性表达CD73、CD90和CD105,而几乎不表达CD45;集落形成分析表明细胞更新和增殖能力强;GMSCs可以在特定诱导条件下分化成脂肪细胞和成骨细胞,提示具有多向分化潜能;GMSCs与ox-LDL诱导下的M1 Mφ共培养后,Mφ的伪足明显减少,形态变圆钝;PCR结果显示GMSCs显著降低M1 Mφ中TNF-α、IL-6和IL-1β的基因水平(P<0.05),并且增加了MRC1和IL-10的基因水平(P<0.05)。上清液中细胞因子的分泌水平不同,共培养组中TNF-α显著降低(P<0.05),而IL-6、IL-1β相对增加(P<0.05)。流式细胞仪检测分析表明,GMSCs显著降低细胞表面CD86和HLA-DR的表达(P<0.05)。油红O染色显示共培养组Mφ中积聚的脂滴较少(P<0.05)。结论THP-1 Mφ与PBMC Mφ有相似的极化表达,THP-1更适合M1极化而非M2极化的研究;通过酶消化法从牙龈组织中分离的GMSCs被鉴定具有干细胞特征;GMSCs通过旁分泌作用抑制ox-LDL刺激后M1巨噬细胞的活化及诱导M2表型,调节炎症反应,并且影响巨噬细胞脂质代谢。