论文部分内容阅读
烯二炔类天然产物由于其特殊的炔-烯-炔环状结构表现出极强的细胞毒性,在抗肿瘤抗生素新药开发中扮演着重要的角色。天赐霉素（Tiancimycins,TNMs）属于十元环烯二炔,具有作为抗体偶联抗癌药物弹头分子的巨大潜能,但是低产量限制了其进一步的临床研究和应用。链霉菌CB03234-S是课题组前期通过核糖体工程获得的TNMs高产菌株,虽然TNMs产量有所提升,但仍不能满足工业化生产的需求。本论文在探索CB03234-S中TNMs高产机制的基础上,以生物合成TNMs的前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A作为关键碳代谢节点,希望通过对碳代谢流的调控来富集前体,从而进一步提升TNMs产量,主要研究内容如下:通过原始菌株CB03234和高产菌株CB03234-S的转录组数据进行对比分析发现,CB03234-S中碳代谢流的增加是TNMs产量提升的原因之一。但是与此同时,同样消耗乙酰辅酶A的脂肪酸合成代谢也明显增强,而与之对应的脂肪酸降解代谢则明显减弱,因此脂肪酸代谢作为前体竞争途径对于TNMs的产量提升是不利的。由于脂肪酸合成对于细胞正常生长至关重要,因此我们从CB3234-S的脂肪酸降解代谢入手,通过调控脂肪酸降解途径促使分流的乙酰辅酶A重新定向到TNMs的生物合成上。首先将五个编码脂肪酸降解代谢相关酶的基因fad D、fad E、paa F、fad J、fad A按照其表达量的高低分为两组,表达量高的fad E和fad A（S-fad-2）以及表达量低的fad D、paa F、fad J（S-fad-3）,将这两组基因分别用启动子erm E和kas Op进行过表达,并同时将五个基因一起过表达（S-fad-5）。三种突变株的TNMs产量均有不同程度增加,其中S-fad-3的产量提升最大,达到21.0±1.2 mg/L,相比于CB03234-S提高了近1.6倍。进一步研究发现,作为脂肪酸降解途径中的首个关键酶编码基因,fad D单独过表达时也能起到和S-fad-3相同的产量提升效果。同时,在这些重组菌株发酵过程中还进行了外源添加脂肪酸实验,发现菌体量明显增加但TNMs产量反而有所降低,说明更多脂肪酸降解后产生的乙酰辅酶A流向初级代谢,反而干扰了次级代谢。转录组数据还揭示了碳代谢中其它与TNMs合成前体有关的酶也存在表达差异。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶是促使碳代谢流从三羧酸循环重新进入糖酵解途径的关键酶,其编码基因pepck的过表达使TNMs产量提升23%（16.3±0.4 mg/L）。acc编码的乙酰辅酶A羧化酶可将乙酰辅酶A转变成丙二酰辅酶A,过表达acc将TNMs产量提升了1.6倍（20.7±1.1 mg/L）。三酰甘油脂肪酶将细胞内的三酰甘油降解为单链脂肪酸,是启动脂肪酸降解代谢的关键酶,其编码基因tag的过表达使TNMs产量提升22%（16.2±1.9 mg/L）,而将源自可高效利用外源脂肪酸的白色链霉菌ZD11的tagZD11在CB03234-S中过表达时,TNMs产量提升了1.6倍（20.6±1.3 mg/L）。前期研究中发现CB03234-S存在一个可能的铜诱导型双向启动子,且Cu2+与TNMs合成密切相关。为了避免组成型启动子诱导的上述碳代谢关键酶的持续性表达对细菌初级代谢产生的不良影响,我们期望通过源自CB03234-S的铜诱导型启动子来控制这些基因的过表达,使其与TNMs合成同步。我们基于不同的抗性基因对构建的铜诱导型启动子体系进行验证,发现该体系调控并不严格,存在本底表达,在没有Cu2+和添加Cu2+条件下并未表现出太明显的差异。另一方面,由于fad D、acc、tagZD11和pepck的单独过表达均能不同程度增加TNMs产量,我们也尝试对这些基因进行组合过表达,以期进一步提升TNMs产量。结果表明这些初级碳代谢关键酶的不同组合表达对细菌的生长产生不同程度的负面影响,导致TNMs产量反而低于单独过表达时的情况,这也预示了初级代谢调控的复杂性,后续还需要围绕上述基因的选择性可控表达以及关键代谢通路的重构来进行探索。本研究通过对链霉菌CB03234-S中以脂肪酸降解为主的碳代谢调控来富集前体乙酰辅酶A,从而提高了药物先导物TNMs产量,并对碳代谢通路的重构进行了初步探索。由于乙酰辅酶A是聚酮类天然产物的通用生物合成前体,本研究的碳代谢调控策略也为其它聚酮类天然产物的产量提升提供了参考。图55幅,表24个,参考文献121篇