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第一部分AS时固有淋巴细胞各亚群的表型鉴定及比例目的:探索动脉粥样硬化(AS)时小鼠固有淋巴细胞(ILC)的表型及比例。方法:采取18周龄的标准饮食的ApoEKO雄性小鼠作为正常对照,通过流式细胞术技术(FACS)检测高脂喂养(HFD)ApoEKO雄性小鼠的AS斑块内及脾脏中固有淋巴细胞(ILC)的表达,然后用定量聚合酶连锁反应技术(RTq-PCR)检测该细胞的基因表达,用酶联免疫法(ELISA)检测该细胞分泌的细胞因子的浓度。结果:在AS时,小鼠脾脏中ILC各群比例均有所升高,且Lin-CD127+ST2-c-kit-表型的细胞升高较为明显。Lin-CD127+ST2-c-kit-表型的固有淋巴细胞表达较高的TH1样的转录因子T-bet和细胞因子IFN-γ,IL-1 β以及IL-6,较低的转录因子GATA3,ROR γ T 以及细胞因子 IL-13,IL-5和IL-17A,但是无 granzyme B,CD56 和IL-15R的表达。结论:由于AS时Lin-CD127+ST2-c-kit-表型的固有淋巴细胞比例升高,并且其表达的细胞因子与TH1作用于AS的细胞因子相同,这说明可能存在着一群与TH1类似的固有淋巴细胞-ILC1参与了 AS的发生发展。第二部分1型固有淋巴细胞促进小鼠动脉粥样硬化斑块形成目的:探索1型固有淋巴细胞是否参与小鼠AS斑块形成方法:标准饮食喂养的ApoE KO小鼠作为对照组,通过FACS检测AS小鼠脾脏中固有淋巴细胞各个群的百分比例。尾静脉注射抗NK1.1抗体以清除ApoE-Rag1 DKO小鼠体内1群固有淋巴细胞(ILC1s和cNK自然杀伤免疫细胞),尾静脉注射抗IL-15R以清除ApoE-Ragl DKO小鼠的cNK细胞。流式分选获取ApoE-Rag1 DKO小鼠脾脏中的ILCls,然后主动转输给抗NK1.1抗体处理的ApoE-Rag1 DKO小鼠。对主动脉根部和整个降主动脉进行油红染色,观察并分析斑块的面积。结果:HFD喂养ApoE KO小鼠的脾脏中ILC的百分比较标准饮食的ApoE KO小鼠的脾脏中ILC的百分比有所增加,并且主要以ILC1为主。通过油红染色,清晰地观察到接受静脉注射抗NK1.1抗体的ApoE-Rag1 DKO小鼠斑块面积较只接受抗IL-15R的ApoE-Rag1 DKO小鼠斑块面积有所减少。并且接受静脉注射抗NK1.1抗体的ApoE-Rag1 DKO小鼠在主动转输从ApoE-/-TLR4+/+小鼠获得的ILCls后斑块面积增加。结论:Lin-CD127+ST2-c-kit-ILCls存在于AS的发展中,且具有促AS进展的作用。第三部分1型固有淋巴细胞促进小鼠动脉粥样硬化斑块形成依赖TL4的表达目的:探讨Toll样受体4(TLR4)是否介导1型固有淋巴细胞作用于小鼠AS斑块的形成。方法:首先利用流式细胞术检测脾Lin-CD127 + ST2-c-kit-IILCls,Lin-CD127 + ST2+ ILC2s和Lin-CD127 + ST2-c-kit + ILC3s细胞中TLR4的表达。将分选出来的Lin-CD127 + ST2-c-kit-ILCls 分别与 pam3CSK4(500ng/mL,TLR2 激动剂),polyI:C(10ug/ml,TLR3 激动剂)和 LPS(100ng/ml,TLR4 激动剂)和 ox-LDL(25ug/ml)共培养3天,然后用ELISA检测上清液中分泌的IL-1β,IL-6,IFN-γ的浓度。ApoE KO小鼠或ApoE-TLR4 DKO小鼠脾脏进行流式分选出Lin-CD127 +ST2-c-kit-ILCl,然后分别主动转输给抗NK1.1处理的ApoE-Ragl DKO小鼠。通过油红0染色,测定主动脉根部及全降主动脉AS斑块面积并进行定量分析。结果:3个固有淋巴细胞亚型中,只有Lin-CD127 + ST2-c-kit-ILCls表达TLR4,并且与LPS/OxLDL作用后可促进其致炎因子的分泌。抗NK1.1抗体处理的ApoE-Rag1 DKO小鼠在主动转输从ApoE KO小鼠的ILCls后斑块面积将会增加,而在主动转输从ApoE-TLR4 DKO小鼠的ILCls后斑块面积无明显变化。结论:ILCls有促进AS的作用,且这一促进作用依赖于TLR4的表达。第四部分OxLDL对1型固有淋巴细胞功能的影响及信号机制目的:探索OxLDL对1型固有淋巴细胞功能的影响及信号机制。方法:利用ApoE KO小鼠和ApoE-TLR4 DKO小鼠进行研究。通过Western蛋白印迹实验检测 ApoE KO 小鼠和 ApoE-TLR4 DKO 小鼠脾脏 Lin-CD127 + ST2-c-kit-ILCls与LPS/OxLDL共同作用下TLR4及相应BACH2的表达。用ELISA试验检测Lin-CD127+ ST2-c-kit-ILCls 与不同剂量 LPS/OxLDL 共同作用后分泌的 IFN-γ、IL-1 β、IL-6的浓度,并用Western检测在相同条件下转录因子BACH2的表达。结果:LPS/OxLDL 可上调 ApoE K0 小鼠 Lin-CD127 + ST2-c-kit-ILCls TLR4 同时下调BACH2的表达,并分泌一定量的致炎因子,但ApoE-TLR4 DKO小鼠的Lin-CD127+ ST2-c-kit-ILCls未见有致炎因子的分泌。高剂量的LPS/OxLDL的刺激ApoE KO.小鼠Lin-CD127 + ST2-c-kit-ILCls可分泌较多的致炎因子,在此同时,检测到其转录因子BACH2的表达是降低的。结论:OxLDL刺激ILCls分泌IFN-γ等致炎因子依赖于TLR4的表达,同时与BACH2的表达相关。