实验目的 颌下腺(submandibular gland，SMG)作为人体三大唾液腺之一，不仅在人体的正常生理活动中发挥着不可缺少的作用，而且在疾病研究方面具有重要的价值。舍一格林综合症、口腔颌面部肿瘤术后放疗及药物过敏或自身免疫性疾病等多种原因造成的涎腺功能严重损害在临床上较为常见，治疗问题十分棘手。组织工程学研究的进展，无疑给解决这一问题带来新的希望，随着细胞生物学和材料工程学的发展，应用组织工程学的方法，在体外培养有生物活性，且在结构和功能上与自体颌下腺相类似的组织工程化颌下腺成为可能。 组织工程化颌下腺的体外构建基本思路是在体外分离培养颌下腺的细胞，扩增到一定数量后，接种在具有一定空间结构的三维生物材料支架上，通过细胞与支架、细胞与细胞之间相互黏附、生长、增殖和分泌细胞外基质，最终形成具有一定结构和功能的组织和器官。因此，种子细胞的培养，可供种子细胞进行生命活动的支架材料筛选与开发，及种子细胞与支架材料相互作用的研究成为组织工程学研究的核心问题。国内学者已经在颌下腺细胞的培养及扩增，生物支架材料的选取及开发方面作出初步探索，而关于颌下腺细胞与支架材料的相互作用方面尚无人问津。 在本研究中，以初步探讨体外颌下腺细胞与胶原海绵支架相互作用为目的，采用体外分离培养SD大鼠颌下腺细胞，然后接种于胶原海绵支架上体外复合培养的方法；从不同接种细胞浓度对细胞一支架复合物影响，同一接种细胞浓度在不同孔隙率的支架上黏附、增殖的情况及表皮生长因子(EGF)对颌下腺细胞的促增殖作用，促细胞在支架上黏附等三方面入手，初步研究了颌下腺细胞与胶原海绵相互作用的影响因素，为进一步在体外及体内构建较为理想的组织工程化颌下腺提供理论参数和实验依据。 实验方法 1．应用胰酶消化法进行颌下腺细胞的分离、纯化及原代培养、传代培养。 2.应用倒置相差显微镜、透射电镜观察培养细胞的形态结构，了解细胞的生长特性。 3.MTr法检测490nm吸光度A值(OD值)，判断细胞活力大小。 4.应用免疫组织化学检测鉴定培养细胞的来源及性质。 5.将细胞浓度为(10一70)x 106/血的领下腺细胞分别接种到胶原海绵支架上，复合培养;于接种后1、3、5、7d通过细胞计数、组织学、超微结构观察及免疫组织化学染色等方法检测何种接种细胞浓度为最佳。 6.将50 x 106/nil细胞浓度的领下腺细胞接种在采用冻干法制备的不同孔隙率的胶原海绵支架上，观察领下腺细胞在何种空隙率支架材料上生长较佳。 7.加人不同浓度的表皮生长因子(EGF)，然后进行领下腺细胞培养，观察表皮生长因子对大鼠SMG细胞增殖的剂量一效应，时间一效应关系，评价表皮生长因子(EGF)对体外培养的大鼠领下腺细胞的促增殖作用。 8.将50 xl护/耐浓度的领下腺细胞接种在表皮生长因子( EGF)修饰的胶原海绵支架上，观察领下腺细胞在表皮生长因子(EGF)修饰的支架上豁附，增殖及分化情况。实验结果 一、领下腺细胞的分离纯化与体外培养、传代。 1.相差倒置显微镜下观察 SMG细胞生长期间呈扁平状，单层生长，为多角形的上皮细胞， 细胞可传代生长3一4代，存活3一4w。 1 .1原代培养 在细胞悬液中获取的细胞形态呈球形，胞浆均匀明亮，轮廓清晰光滑。接种后24h一36h，大部分细胞开始贴壁，细胞形态无明显改变，但折光性减低。48h细胞胞体逐渐延伸生长，4一5天可见完全伸展的细胞呈扁平多边形，细胞大小是伸展前的3一4倍。至9一10天，可见新生领下腺细胞呈大小均一的多角形，单层生长，部分聚集成细胞岛。 1.2传代培养 细胞传代后较原代生长加快，24h后即可贴壁伸展，7一9天可形成单层细胞。第2代细胞形态与原代相似，细胞经反复传代后形态出现变化，从第3代开始出现细胞死亡，第4代死亡细胞数量增加，且细胞形态逐渐变得不规则，细胞界限模糊，胞内出现细小空泡及黑色小颗粒。 2.细胞增殖能力测定 接种72h后，MTT法测得各代细胞的吸光度A值显示(表1一l)原代、第2代与第4代相比较有显著性差异(P<0.05)。 3.免疫组化染色鉴定 免疫组化观察检测结果显示，原代培养纯化后细胞Anti一Pan cytokera-tin、Anti一EMA染色呈(+)，胞浆内可见有棕黄色颗粒，表明细胞为上皮细胞来源。 4.透射电镜超微结构观察 透射电镜下观察培养72h的原代领下腺细胞，可见细胞呈立方状，顶端有微绒毛，侧面有连接复合体，细胞核呈圆形，线粒体、内质网发达，多分布在核的顶部一侧，胞浆内含有分泌颗粒。 二、领下腺细胞与胶原海绵支架复合培养的最佳细胞浓度的实验研究 1.领下腺细胞与胶原海绵复合物的细胞计数 l天时，各组复合物上细胞数均有104一105/祖数量级，7天时，各组细胞数较1天时均有增加，但其中50一70 x 106/耐各组中细胞数增加2倍，而ro一40 x 106/rril各组中增加不明显，仅达0.5倍。 2.领下腺细胞与胶原海绵复合物的组织学观察 HE染色可见细?