目的：　　MALAT1在进化上是一种高度保守的长链非编码 RNA（LncRNA），其首先被证明与肺部肿瘤转移相关，机制可能是促进血管生成。最近研究表明，活化的血管系统可通过分泌神经营养因子，例如BDNF、Ang-1和SDF-1α，促进神经再生。本课题研究MALAT1在创伤性脑损伤（TBI）后血管重塑和神经再生中的作用及其机制。　　方法2：　　第一部分 MALAT1对血管再生的作用及机制研究。　　实验一：MALAT1对血管再生的作用研究。　　体外实验：在OGD后24小时，通过慢病毒抑制MALAT1后，进行细胞增殖、迁移和血管形成实验。将细胞随机分成2组：OGD+空白对照和OGD+ LV siMALAT1(100 MOI1μl/100μl)。N=4/组。　　在体实验：在CCI后第7天，通过腺相关病毒抑制MALAT1后，进行CD31/Brdu和Lectin的免疫组织化学染色。将小鼠随机分为2组：CCI+空白对照和CCI+ AAV siMALAT1（4μl/小鼠）。N=5/组。　　实验二：MALAT1对血管再生的机制研究（一）。　　在体实验：为了动态检测MALAT1、EZH2和NOTCH1的变化情况，我们在TBI损伤后6小时和第1、3、7、14、21和28天，进行了PCR实验。将小鼠随机分为2组：假手术组和CCI组，N=4/时间点。在CCI后第7天，通过FISH实验对MALAT1进行定位。　　体外实验：在 OGD后48小时，也通过 PCR检测了内皮细胞MALAT1的表达水平。将细胞随机分成2组：对照组和OGD组。在OGD后，通过RNA pull-down鉴定MALAT1和EZH2之间的相关性。N=4/组。　　生物信息学：通过两种生物信息学软件-RNA-protein interaction和Starbase，进一步预测MALAT1与EZH2之间的关系。　　实验三：MALAT1对血管再生的机制研究（二）。　　体外实验：在OGD后24小时后，通过过表达EZH2、活化NOTCH1通路，与下调MALAT1联合干预，进行细胞增殖、迁移和血管形成实验。将细胞随机分成3组：OGD+空白对照、OGD+ LVsiMALAT1（100 MOI1μl/100μl）和OGD+ LVsiMALAT1（100 MOI1μl/100μl）+pcEZH2（10μg/100μl)）或Jagged-1（1μg/100μl）。N=4/组。　　体内实验：在CCI后第7天，通过过表达EZH2、活化NOTCH1通路，联合下调MALAT1双重干预后，进行CD31/Brdu和Lectin的免疫组织化学染色。将小鼠随机分为4组：CCI+空白对照、CCI+AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）、CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）+Jagged-1（1 ng/ml）和CCI+AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）+ pcEZH2。N=5/组。　　实验四：MALAT1对血管再生的机制研究（三）。　　体外实验：抑制MALAT1后，检测EZH2、NOTCH1、HES1的蛋白水平。将细胞随机分成2组：OGD+空白对照和OGD+LVsiMALAT1（100 MOI1μl/100μl）。N=4/组。（HES1为NOTCH1通路下游蛋白）。　　体外实验：抑制EZH2后，检测NOTCH1的蛋白水平。将细胞随机分成2组：OGD+空白对照和OGD+ GSK126（100μM）。N=4/组。　　体外实验：过表达 EZH2联合下调 MALAT1双重干预后，检测NOTCH1、HES1的蛋白水平。将细胞随机分成3组：OGD+空白对照、OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）和OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）+ pcEZH2（10μl/100μl）。N=4/组。　　实验五：通过 MALAT1的核酸抑制剂，验证 MALAT1对血管重塑的作用。　　体外实验：在OGD后24小时，通过LNA GampeR抑制MALAT1后，进行细胞增殖、迁移和管腔形成实验。将细胞随机分为2组：OGD+空白对照和OGD+ LNA GampeR MALAT1（100 nmol/L）。N=4/组。　　在体实验：在CCI后第7天，通过LNA GampeR抑制MALAT1后，进行CD31/Brdu和Lectin的免疫组织化学染色。将小鼠随机分为2组：CCI+空白对照和CCI+ LNA GampeR MALAT1（2 mg/kg）。N=5/组。　　第二部分 MALAT1对神经再生的作用及机制研究。　　实验一：MALAT1对神经再生的作用研究。　　在体实验：神经干细胞增殖、成神经细胞迁移和神经元增殖是神经再生的重要标志。我们于CCI后第7天，通过AAV抑制MALAT1后，进行免疫组化染色Nestin、DCX/Brdu和NeuN/Brdu，对神经生成进行检测。将小鼠随机分成2组：CCI+空白对照和CCI+AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）。N=5/组。　　实验二：MALAT1对神经再生的机制研究。　　在体实验：在活化NOTCH1通路联合下调MALAT1双重干预后，通过免疫组织化学检测神经再生。将小鼠随机分成3组：CCI+空白对照、CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）和CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）+ Jagged-1（1 ng/ml）。N=5/组。　　第三部分血管再生对神经再生的作用研究。　　实验一：MALAT1-EZH2-NOTCH1通路对SDF-1α的作用研究。　　体外实验：抑制MALAT1后，检测内皮细胞三种分泌因子SDF-1α、Ang1和BDNF的蛋白水平。将细胞随机分成2组：OGD+空白对照和OGD+ LVsiMALAT1（100 MOI1μl/100μl）。N=4/组。　　体外实验：过表达 EZH2联合下调 MALAT1双重干预后，检测SDF-1α、Ang1和BDNF的蛋白水平。将细胞随机分成3组：OGD+空白对照、OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）和OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）+ pcEZH2（10μl/100μl）。N=4/组。　　体外实验：活化 NOTCH1通路联合下调 MALAT1双重干预后，检测SDF-1α，Ang1和BDNF的蛋白水平。将细胞随机分成3组：OGD+空白对照、OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）和OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）+ Jagged-1（1μg/100μl）。N=4/组。　　实验二：SDF-1α对神经再生的作用研究。　　在体实验：CCI后第7天，抑制SDF-1α后通过免疫组织化学检测神经再生。将小鼠随机分成2组：CCI+空白对照（生理盐水1 mg/kg）和CCI+ AMD3100（1 mg/kg）。N=5/组。　　实验三：MALAT1-SDF-1α轴对神经再生的作用研究。　　在体实验：CCI后第7天，使用重组蛋白质 SDF-1α联合下调MALAT1双重干预后，通过免疫组织化学检测神经再生。将小鼠随机分成3组：CCI+空白对照、CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）和CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）+ SDF-1α（1 ng/ml/小鼠）。N=5/组。　　第四部分 MALAT1对脑血流灌注及神经功能的作用研究。　　实验一：MALAT1对脑血流灌注的作用研究。　　在体实验：抑制MALAT1后，通过PSI监测血流变化，对脑血流灌注进行评估。将小鼠分成3组：CCI+空白对照、CCI7d+AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）和CCI10d+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）。　　实验二：MALAT1对神经功能的作用研究。　　在体实验：过表达EZH2联合下调MALAT1双重干预后，通过NSS、抓线测试、Morris水迷宫实验对神经功能进行评估。将小鼠随机分成4组：假手术组、CCI+空白对照、CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）和CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）+ pcEZH2（6μl/小鼠）。N=6/组。　　实验三：MALAT1对TBI伤灶体积的影响。　　在体实验：抑制MALAT1后，通过HE染色对伤灶体积进行检测。将小鼠分成2组：CCI+空白对照和CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）。N=5/组。　　实验四：MALAT1的副作用研究。　　在体实验：抑制MALAT1后，通过ELISA检测TBI后急、慢性期炎性细胞因子TNF-α、IL-6和 IL-1β的表达水平。将小鼠随机分成6组：假手术组+空白对照、假手术组+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）、CCI3d+空白对照、CCI3d+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）、CCI21d+空白对照和CCI21d+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）。N=5/组。　　由于技术上的限制，目前尚无法构建MALAT1的过表达载体，我们只能通过抑制MALAT1表达，进行反面的理论验证。　　结果：　　第一部分 MALAT1对血管再生的作用及机制研究。　　实验一：体外实验发现，抑制MALAT1后，血管腔管的形成、内皮细胞的增殖受到抑制，但是内皮细胞的迁移增强（P<0.05）。在体实验发现，抑制MALAT1后，CCI后的内皮细胞增殖和功能血管密度也受到明显抑制（P<0.05）。　　实验二：在体实验发现，与假手术组相比，CCI后6小时，MALAT1水平明显升高（P<0.05），第14天仍然维持在较高水平（P<0.05）。CCI后，EZH2和NOTCH1的RNA水平变化，显示出与MALAT1相似的趋势。RNA-FISH显示，小鼠脑内存在大量与MALAT1具有免疫反应活性的血管内皮细胞。　　体外实验发现，OGD后24小时，内皮细胞中MALAT1水平显著升高（P<0.05）。RNA pull-down实验证明，在内皮细胞中MALAT1可与EZH2相互结合。通过RNA-protein interaction prediction　　(http://pridb.gdcb.iastate. edu/RPISeq/)软件预测了MALAT1与RNA结合蛋白之间的结合概率，发现MALAT1结合EZH2的可能性极高（RF或[SVM]分值>0.5）。Starbase软件也提供了类似的证据。这些数据表明在转录水平上，MALAT1可通过表观遗传学调控潜在的靶基因表达。　　实验三：体外实验发现，抑制MALAT1联合过表达的EZH2或活化的NOTCH1通路，逆转了siMALAT1介导的抑制内皮细胞增殖、管腔形成和促进细胞迁移作用（P<0.05）。我们在补充实验中也证明，抑制EZH2和NOTCH1通路12小时和24小时后，内皮细胞增殖均受到明显抑制（P<0.05）。　　在体实验发现，CCI后MALAT1对内皮细胞增殖和功能血管密度的促进作用，也被过表达 EZH2或激活 NOTCH1信号通路联合MALAT1下调双重干预所逆转（P<0.05）。　　实验四：体外实验发现，抑制MALAT1后，内皮细胞中EZH2和NOTCH1的蛋白质水平显著下降（P<0.05）。此外，抑制EZH2后， NOTCH1信号通路亦被抑制（P<0.05）。另外，过表达EZH2联合下调MALAT1，逆转了siMALAT1介导的NOTCH1和HES1抑制效应（P<0.05）。　　实验五：体外实验发现，与之前的结果一致，LNA GampeR MALAT1显著抑制管腔形成、内皮细胞增殖，促进了内皮细胞的迁移（P<0.05）。在体实验发现，LNA GampeR MALAT1抑制了小鼠脑的内皮细胞增殖和功能血管密度（P<0.05）。　　第二部分 MALAT1对神经再生的作用及机制研究。　　实验一：在体实验发现，在CCI后，siMALAT1组的Nestin阳性细胞、BrdU/DCX阳性细胞以及BrdU/NeuN阳性细胞数量较对照组显著减少（P<0.05）。说明MALAT1可促进神经干细胞增殖、成神经细胞迁移和神经元增殖。　　实验二：在体实验发现，活化 NOTCH1信号通路联合下调MALAT1，逆转了 MALAT1对神经细胞迁移的促进作用。CCI后， siMALAT1+ Jagged-1组BrdU/DCX阳性细胞数量比siMALAT1组显著增加（P<0.05）。此外，双重干预也逆转了MALAT1对成熟神经元增殖的促进作用。在CCI后，siMALAT1+ Jagged-1组的BrdU/NeuN阳性细胞数量比siMALAT1组也显著增加（P<0.05）。　　第三部分血管再生对神经再生的作用研究。　　实验一：体外实验发现，抑制MALAT1后，内皮细胞三种分泌因子SDF-1α、Ang1和BDNF中，只有SDF-1α的蛋白水平显著降低（P<0.05）。过表达EZH2联合MALAT1下调，可逆转MALAT1对SDF-1α在的促进作用（P<0.05）。此外，激活NOTCH1通路联合下调MALAT1，亦可逆转MALAT1对SDF-1α的促进作用（P<0.05）。我们在补充实验中证明，抑制EZH2和NOTCH1后，SDF-1α的表达也受到显著抑制（P<0.05）。　　实验二：在体实验发现，CCI后AMD3100组的BrdU/DCX阳性细胞数量较对照组显著降低（P<0.05）。另一方面，抑制SDF-1α后，血管内皮周围的DCX阳性细胞数量显著减少（P<0.05），提示神经血管单元数目的减少。　　实验三：在体实验发现，使用 SDF-1α重组蛋白和下调 MALAT1的联合干预，逆转了CCI后MALAT1对成神经细胞迁移的促进作用（P<0.05）。荧光实验显示，SDF-1α可由脑血管内皮分泌。此外，SDF-1α重组蛋白联合下调MALAT1，也逆转了MALAT1对神经血管单位的促进作用（P<0.05）。　　第四部分 MALAT1对脑血流灌注及神经功能的作用研究。　　实验一：在体实验发现，在CCI后第7天和第10天，抑制MALAT1后，损伤区域的脑血流灌注显著降低（P<0.05）。　　实验二：在体实验发现，在NSS中，siMALAT1动物组比对照组动物出现更严重的感觉运动功能受损（P<0.05）；过表达EZH2可逆转MALAT1对小鼠感觉运动的促进作用（P<0.05）。对于抓线试验， siMALAT1组动物比对照组动物抓持能力显著降低（P<0.05）；EZH2过表达也逆转了MALAT1对抓持的促进作用（P<0.05）。最后，Morris水迷宫实验显示，siMALAT1组动物比对照组动物需花费更多的时间来发现隐藏在水里的平台（P<0.05）。在CCI后第20天，相比于对照组动物，siMALAT1组动物的停留时间明显降低、游行的路径长度和穿越平台的次数明显减少（P<0.05）。过表达EZH2逆转了MALAT1介导的促进认知功能效应（P<0.05）。水迷宫实验提示MALAT1可促进小鼠的学习能力和空间记忆能力。　　实验三：在体实验发现，与对照组相比，抑制 MALAT1后，TBI造成的伤灶体积并无显著变化（P>0.05）。　　实验四：在体实验发现，在脑创伤急、慢性期，与对照组相比， siMALAT1组的三种炎性因子TNF-α、IL-6和 IL-1β均无显著变化（P<0.05）。提示MALAT1并未引起神经炎症等副作用。　　结论：　　MALAT1可通过EZH2-NOTCH1通路促进血管重塑，随后活化的血管系统增加了SDF-1α的合成。最终促进了TBI后的神经再生和功能恢复。