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日本脑炎病毒和登革病毒是属于黄病毒科黄病毒属的虫媒病毒。目前对它们的发病机制知之甚少,严重阻碍了对日本脑炎和登革热疾病的预防控制,因此迫切需要探索新方法去研究它们的发病机制。本研究应用展示了日本脑炎病毒(JEV)或登革病毒2型(DEN-2)E蛋白Domain III的鼠伤寒沙门氏菌BRD509侵袭靶细胞来模拟病毒感染,建立病毒的体外模拟感染体系,探讨应用该实验体系研究病毒发病机制的可行性,并尝试研究JEV感染早期细胞凋亡在发病机制中的作用。
首先,通过比较冰晶核蛋白(INP)的N端结构域(INPN)和包含其N端、C端结构域的融合蛋白(INPNC)这两种展示基序在鼠伤寒沙门氏菌中的展示效果,选择了INPN为载体在鼠伤寒沙门氏菌BRD509中分别展示日本脑炎病毒E蛋白Domain III(JEDIII)、登革病毒2型E蛋白Domain III(D2EIIII),构建出可用于模拟病毒体外感染的重组鼠伤寒沙门氏菌株。
展示D2EIII的重组菌经抗体预作用后,可以通过类似发生于活病毒感染细胞时的抗体依赖增强作用(ADE)的方式促进重组菌的侵袭力,除证实了模拟感染的有效性外,也表明模拟感染系统可用于登革病毒的增强抗体和中和抗体筛选。在评价重组菌侵袭力时,设计了一种结合全细胞ELISA和细胞表面ELISA的方法以补充常规方法的不足,该方法具有推广应用的价值。
通过研究展示JEDIII的重组菌及经鼠伤寒沙门氏菌传递全长E基因对SK-N-SH细胞的DNA损伤及凋亡相关基因表达的影响,表明JEDIII和全长E蛋白对鼠伤寒沙门菌所致细胞损伤存在影响,为应用模拟感染研究深入研究JEV致中枢神经细胞凋亡机制提供了新的思路和技术方法。
为了深入了解模拟感染中展示蛋白及载体菌株各自发挥的作用,应用纯化蛋白在体外结合细胞,并且也应用展示了病毒蛋白的大肠杆菌TOP10去粘附细胞。结果显示展示JEDIII的TOP10粘附在体外具有较高结合纯化JEDIII蛋白活性的BHK细胞的能力并未得以提高,表明展示JEDIII不易显著增高细菌的侵袭力。但应用于模拟感染中重组菌株其它组分对宿主细胞的影响还有待进一步研究。
本研究为建立可方便应用于研究病毒发病机制的、符合生物安全的实验系统奠定了技术基础,同时也拓宽了细菌表面展示技术的应用范围。