论文部分内容阅读
布鲁氏菌病（Brucellosis）简称“布病”,是革兰阴性、兼性胞内寄生菌布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人兽共患传染病,广泛流行于世界各地,严重威胁人类健康,给畜牧业生产造成了巨大损失。布鲁氏菌可感染人、牛、羊、猪、鹿、犬及多种野生动物,人类通常通过接触受感染动物及其分泌物,或进食受污染的肉类或奶制品而遭感染。2016年,农业部、国家卫生计生委发布《国家布鲁氏菌病防治计划（2016—2020年）》,2022年,农业农村部发布了《畜间布鲁氏菌病防控五年行动方案（2022-2026）》。加强动物布病监测,及早发现并剔除阳性个体是布病防控的重要措施之一。为了建立布病检测的竞争ELISA方法,本研究选取保守性高、免疫原性良好的布鲁氏菌外膜蛋白16（OMP16）,通过生物信息学软件分析了OMP16的结构、理化性质和B细胞线性表位;同源重组法构建布鲁氏菌OMP16原核表达载体及其表达纯化;通过小鼠杂交瘤技术筛选到OMP16特异性杂交瘤细胞株8株,获得了纯化的OMP16单克隆抗体;建立了布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法。试验结果如下:（1）NCBI网站获取B.suis.S2菌株OMP16核酸和氨基酸序列,Prot Param软件预测OMP16由168个氨基酸组成,相对分子质量18 ku,蛋白等电点PI=9.92,大肠杆菌体内半衰期大于10 h,不稳定系数为43.86,属于不稳定蛋白质,脂肪系数78.57,属于脂蛋白,热稳定性良好;TMHMM和Signal P预测OMP16在1～24氨基酸处有信号肽序列,6～28氨基酸处存在一段跨膜区;IEDB预测OMP16具有7个B细胞线性表位,位于6～8、27～51、62～72、87～88、100～110、128～130、136～155氨基酸处。克隆无信号肽和跨膜区的omp16（uomp16）序列,同源重组法构建了p GEX-4T-1-uomp16原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,经1.0 mmol/L IPTG,22℃,诱导8 h,成功表达,GST树脂亲和层析法获得纯化的重组GST-u OMP16（r GST-u OMP16）;扩增原核表达载体p ET32a-omp16,转入大肠杆菌BL21,经1.0 mmol/L IPTG,22℃,诱导8 h,成功表达,NTA树脂亲和层析法获得纯化的重组His-OMP16（r His-OMP16）;Western-Blot结果表明,r His-OMP16和r GST-u OMP16具有良好的反应原性。（2）rHis-OMP16与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后免疫小鼠,经i ELISA方法检测小鼠血清中OMP16抗体水平达到1×10~6～10~7,rGST-uOMP16作包被抗原,小鼠高免/阴性血清作一抗,确定i ELISA方法最佳抗原包被浓度为0.5μg/m L、最佳酶标二抗稀释倍数为1∶5000,建立了OMP16抗体筛选的i ELISA方法。小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层细胞,免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%PEG 4000作用下融合,经筛选,获得8株OMP16特异性杂交瘤细胞株,命名为B7、D1、D2、D3、E6、F5、H4和H11。其中,B7、D1、D3或F5为Ig M-κ型,D2、H4或H11为Ig G1-κ型,E6为Ig G2b-κ型,且杂交瘤细胞核型正常,单抗特异性高。（3）优化最佳抗原包被浓度、抗体稀释倍数、血清稀释倍数、酶标二抗稀释倍数或最佳封闭条件,检测28份羊临床阴性血清,确定临界值,建立了布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法:0.625μg/ml r GST-OMP16 100μL/孔,4℃过夜包被;TBST Buffer200μL/孔,洗涤3次;3%明胶封闭液100μL/孔,37℃封闭2 h;TBST Buffer 200μL/孔,洗涤3次;抗体1∶200稀释、血清1∶10稀释,混匀后100μL/孔,37℃孵育1 h;TBST Buffer 200μL/孔,洗涤3次;酶标二抗1∶15000稀释,100μL/孔,37℃孵育1h;TBST Buffer 200μL/孔,洗涤3次;TMB显色液100μL/孔,37℃孵育30 min;2 M硫酸终止液50μL/孔,终止反应,当PI%≥39.2%时,判为阳性;PI%＜39.2%时,判为阴性;32.2%＜PI%＜39.2%,判为可疑。检测了羊临床血清样本60份,与第三方检测结果相比,符合率为95%,具有良好的一致性。本研究表达了布鲁氏菌OMP16、筛选了OMP16特异性杂交瘤细胞株,建立了OMP16抗体竞争ELISA方法,有望为布鲁氏菌的临床防控提供特异性高、敏感性好的检测方法。