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目的:通过观察GM诱导大鼠肾损伤及修复过程中自噬水平的变化及其与肾损伤程度的相关性,探讨自噬在肾损伤期及修复期内可能发挥的作用。方法:1.健康SD大鼠随机分为:空白对照组(control,Con),庆大霉素组(gentamicin,GM)和雷帕霉素组(rapamycin,RAP)。对照组大鼠腹腔注射生理盐水,其他各组大鼠每天腹腔注射GM 100 mg·kg-1,连续7d。同时RAP组大鼠每天灌胃RAP 1.5 mg·kg-1,连续17d。分别在给药2d,5 d,7d,10d,12d,15 d,17d后采集动物肾、血、尿液等样本。观察各组大鼠肾指数变化水平;检测血清中肌酐(serum creatinine,Cre)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN);收集24h尿液,检测尿液中肾损伤分子1(Kidney injury molecule1,KIM-1)、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D-glucosamidase,NAG)表达水平,Western blot检测肾组织中各时间点微管相关蛋白轻链 3(Microtubule-associated protein light chain 3,LC3 Ⅱ)、自噬相关蛋白Beclin1及P62蛋白的表达情况;免疫组织化学检测肾组织中LC3 Ⅱ蛋白的表达及分布情况;采用Pearson相关性分析方法评判LC3 Ⅱ、P62与大鼠肾损伤指标KIM-1、NAG的相关性;苏木精-伊红(HE)染色观察分析各时间点肾组织病理变化;透射电镜观察分析肾组织的超微结构。2.GM(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg ml-1)、RAP(1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00μM)、3-MA(0.08、0.16、0.31、0.62、1.25、2.5mM),分别作用于 HK-2 细胞6h、12h、24h,MTT法检测GM、RAP、3-MA对HK-2细胞增殖抑制情况以确定合适的药物浓度;动态细胞成像及分析系统考察GM(0.50 mg·m l-1)、RAP(625μM)、3-MA(0.16mM)作用24h过程中HK2细胞增殖情况及形态的变化;Western blot、免疫荧光检测GM(0.50mg·ml-1)、RAP(6.25μM)、3-MA(0.16mM)作用 HK-2 细胞 6h、12h 及 24h 后,HK-2细胞中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白的表达情况。结果:1.GM连续腹腔注射7d后停止给药,GM组和RAP组中肾指数、血清Cre、BUN和尿液中KIM-1、NAG等水平在2-10d持续升高,而在10-17d时间段,均出现不同程度降低,且在部分时间点与表达水平最高时比较有显著差异,此外RAP组中部分时间点血清Cre、BUN和尿液中KIM-1、NAG水平显著低于GM组;病理结果显示,对照组大鼠肾脏未见明显异常,GM组和RAP组在2-10d时间段细胞脱落、坏死数目及炎细胞浸润逐渐增多,而在10-17d时间段,损伤程度均出现不同程度降低;Pearson相关分析表明,GM组KIM-1、NAG与LC3Ⅱ表达水平呈正相关,而与P62表达水平呈负相关;Western结果显示,GM组中LC3Ⅱ与Beclin1在2-10d显著性升高,P62显著降低,而在10-17d过程中,P62维持在高表达水平,LC3 Ⅱ与之相反。RAP组中,在2-10d LC3 Ⅱ表现出一定水平的提高,P62与之相反,在10-17d LC3 Ⅱ表达水平持续增强;免疫组化结果显示,GM组和RAP组在2-10d过程中LC3均显著表达,而在10-17d过程中,GM组出现一定程度降低,而RAP组中LC3维持高表达水平。此外,电镜结果显示,在7d时GM组自噬体数目较多,而在RAP组中,7d和17d自噬体数目较多,同时损伤程度明显减轻。2.MTT结果显示,GM、RAP及3-MA分别作用HK-2细胞6、12、24h后,选择GM、RAP及3-MA的合适浓度分别为0.5mg·ml-1、6.25μM和0.16mM。GM作用于HK2细胞后,分别应用自噬诱导剂RAP和自噬抑制剂3-MA干预,观察6、12、24h自噬水平变化。Western结果显示GM与RAP联用后,在6、12、24h,细胞内LC3Ⅱ及Beclin1表达均显著增多,GM与3-MA联用12h后,细胞内LC3 Ⅱ及Beclin1表达被抑制;免疫荧光显示RAP作用细胞24h后,细胞内LC3和Beclin1水平显著增多,而3-MA作用细胞24h后,细胞内LC3和Beclin1表达水平较低;动态细胞成像及分析系统观察发现GM作用下大部分细胞显著皱缩,体积缩小变圆,而加入RAP后细胞皱缩比例及漂浮细胞数目均较GM组略小,而加入3-MA后漂浮细胞数目增多。结论:1.肾脏在2-10d的时间段损伤程度呈进行性加重,作为肾损伤期,而在10-17 d时间段,肾功能进行性恢复,作为修复期。在肾损伤呈进行性加重期间,自噬水平也呈进行性升高。在损伤早期增强自噬活性水平可降低肾损伤,随着损伤的进行性加重,自噬活性持续增强,对肾损伤的发展有一定的影响,在修复期内增强自噬活性水平对肾损伤发挥保护作用。2.GM作用于HK2细胞24h时间内,细胞受损过程中,自噬活性水平提高。此时间段,自噬诱导剂R AP可增强自噬活性从而减轻细胞受损程度,而自噬抑制剂3-MA,在一定程度的损伤阶段可抑制自噬活性从而加重细胞损伤,表明在GM诱导细胞损伤过程中,在一定的损伤阶段增强自噬可能对损伤细胞发挥保护作用。