甲基磺酸甲酯对丛枝病泡桐基因表达影响研究

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泡桐丛枝病是由植原体引起的一种传染性病害,给泡桐产业化生产带来了巨大的损失,是我国林业生产中亟需解决的问题之一。在过去的40多年中,科研工作者对泡桐丛枝病的寄主和病原两方面进行了研究,在丛枝病泡桐方面,科研人员进行了大量的生理生化及相关的基因表达研究,对丛枝病植原体也开展了病原的传播途径,分类,繁殖方式等研究工作,但是由于植原体很难体外培养,致使丛枝病的发病机理仍不清楚,因此,本研究利用现代生物技术手段,分别从形态学水平,DNA水平,RNA水平和表观遗传水平研究了植原体侵入对白花泡桐,豫杂一号泡桐和毛泡桐DNA碱基序列,DNA甲基化和基因表达的变化。现将结果归纳如下:1.适宜浓度的甲基磺酸甲酯(MMS)处理可以清除丛枝病幼苗体内的植原体,并使丛枝病幼苗转变为健康苗。通过对3个种泡桐丛枝病幼苗的MMS处理,本研究发现3个种泡桐丛枝病幼苗对MMS的敏感性不同:豫杂一号泡桐丛枝病幼苗在大于30mg·L–1MMS浓度处理下能转变为健康苗,且巢式PCR检测不到植原体特异的1.2kb条带,小于该浓度则仍有弱小腋芽存在,并能检测到植原体的特异片段;毛泡桐和白花泡桐丛枝病幼苗则需要40 mg·L–1MMS浓度才能清除体内的植原体,小于该浓度则既能观察到腋芽又能检测到植原体的特异片段。2.植原体侵入在AFLP水平上没有改变泡桐的DNA碱基序列。通过对3个种泡桐丛枝病幼苗,MMS处理的丛枝病幼苗和对应健康苗的DNA碱基序列的AFLP分析,发现植原体侵入泡桐后,泡桐基因组DNA碱基序列在AFLP水平上没有发生变化。3.植原体侵入引起了泡桐DNA甲基化水平和模式的变化。本研究利用MSAP技术分析了3个种丛枝病幼苗在转变为健康苗过程中的DNA甲基化水平和模式发生了变化,结果显示3个种泡桐丛枝病幼苗的DNA甲基化水平均低于对应的健康苗,并且在外源甲基剂MMS处理后,DNA甲基化水平升高;同时,DNA甲基化模式也发生了明显的变化,3个种泡桐丛枝病幼苗形态变化过程共存在DNA甲基化模式和去甲基化模式,但均以甲基化模式为主。4.植原体侵入改变了泡桐相关基因的表达。通过MSAP分析,本研究发现3个种泡桐幼苗在植原体侵入后甲基化模式变化较大,通过对比分析,本研究在白花泡桐丛枝病幼苗形态转变的过程中克隆到了81个差异基因,在豫杂一号泡桐中获得72个差异基因,在毛泡桐中获得60个,通过对比这3个种之间获得的差异基因的序列和功能,发现有2个基因在3个种中同时存在,意味着这2个基因在丛枝病发生过程中起重要作用。通过转录组测序技术,在豫杂一号泡桐和毛泡桐(Ⅰ)和(Ⅱ)中分别找到了74,2540和902个差异表达的unigenes,在这些差异基因中,本研究找到了与次生代谢相关的基因,特别是叶酸合成相关的基因和类黄酮合成相关的基因,与脂肪酸合成相关的基因,与糖酵解和糖异生途径相关的基因,与表观遗传中的DNA甲基化和蛋白质乙酰化相关的基因,与光合作用和碳水化合物代谢相关的基因,与丛枝病症状表达相关的基因,与植物防御相关的基因。通过比较这些差异基因的序列和功能,共找到9个序列和功能相同的基因,同时,从上述差异基因中,我们挑出42个差异基因进行q PCR验证,结果显示q PCR的结果与转录组分析结果一致,该结果充分肯定了转录组结果的正确性及可靠性。该结果给泡桐-植原体相互作用的研究提供了新的视角。
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