本研究采用细胞培养、DAPI和MDC染色、RNA干扰、荧光蛋白标记、Western blotting等细胞分子生物学方法和技术,以PC12细胞和小鼠原代神经元为实验对象,综合研究了鱼藤酮对神经细胞自噬水平的影响,并深入探讨了鱼藤酮诱导神经细胞凋亡与自噬抑制的关系。结果如下:1鱼藤酮诱导神经细胞自噬抑制PC12细胞和小鼠原代神经元、或感染Ad-GFP-LC3的PC12细胞和小鼠原代神经元,以不同浓度鱼藤酮(0-1 μM)处理24 h,或用鱼藤酮(1 μM)处理(0-24 h),观察细胞 GFP-LC3puncta 变化;Western blot 分析 Atg5、P62、LC3 蛋白表达。结果显示:鱼藤酮以浓度和时间依赖地方式诱导细胞GFP-LC3 puncta数量减少,以及LC3-Ⅱ减少和p62表达增加。提示:鱼藤酮引起神经细胞PD模型中自噬抑制。2鱼藤酮诱导自噬抑制导致神经细胞凋亡PC12细胞和小鼠原代神经元、或感染shRNA LC3-Ⅰ/Ⅱ、shRNA Atg5、shRNA GFP、Ad-GFP-LC3的PC12细胞,用不同浓度鱼藤酮(0-1 μM)处理24h、或用雷帕霉素(0.2 μg/ml)预处理2 h后鱼藤酮(1 μM)处理24 h,MDC染色和GFP-LC3荧光拍照评估细胞自噬体变化,DAPI染色分析细胞凋亡,Western blot检测 Atg5、P62、LC3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP 表达。结果显示:雷帕霉素逆转鱼藤酮诱导神经细胞MDC荧光强度降低和凋亡增加;下调LC3-Ⅰ/Ⅱ或Atg5强化鱼藤酮诱导神经细胞MDC荧光强度或GFP-LC3 puncta数量降低以及调亡增加。提示:鱼藤酮诱导自噬抑制导致神经细胞凋亡。