论文部分内容阅读
背景与目的：缺血性脑血管病的血管的闭塞启动了缺血性的病理过程，缺血以及随后的再灌注损伤是血管内皮细胞损伤的主要因素，而内皮细胞的损伤及坏死又触发了细胞间连接蛋白以及内皮细胞与基底膜之间连接的破坏，从而导致血脑屏障完整性的破坏，进而引发一系列的级联反应。同时，内皮细胞或内环境的稳定也能够影响神经系统的形态发生。因此维持内皮细胞的稳定是缺血急性期治疗的关键，Fibulin-5是细胞外间质的重要组成部分，在组织的形成、重建和修复等各种生理过程中都起着关键的作用。Fibulin-5作为一种多功能蛋白涉及到细胞间以及细胞与细胞外基质的联系，其表达变化可以影响到内皮细胞的粘附、增殖和迁移。Fibulin-5在胚胎脉管系统及神经嵴中有强烈的表达，但在成年组织中出现表达降低，而且在有血管重建或再生的组织中有明显的激活与表达上调。近年来的研究发现，正常成人血管内皮细胞中fibulin-5的表达很低，在损伤的血管以及缺血条件下的内皮细胞中fibulin-5表达明显升高。本实验拟观察fibulin-5在缺血早期大鼠脑组织中的变化规律以及其与血脑屏障通透性的相关性，从而了解fibulin-5在脑缺血过程中所起的作用，并且观察小脑顶核电刺激（fastigial nucleus stimulation，FNS）对缺血再灌注（ischemiareperfusion，IR）大鼠脑组织中fibulin-5表达的影响，为探索治疗缺血性脑血管病提供新的思路。方法：第一部分：成年雄性SD大鼠108只，随机分为正常组、假手术组、IR模型6h、24h、48h和72h组。线栓法制备局灶性右侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，伊文思蓝（Evan Blue，EB）检测血脑屏障（Blood Brain Barrier，BBB）的通透性，激光共聚焦定位检测fibulin-5在脑组织内的表达，实时定量PCR测定fibulin-5mRNA表达规律，Western blot检测缺血后fibulin-5蛋白表达变化。第二部分：成年雄性SD大鼠100只，随机分为假手术组、IR模型组（24h）和干预组（FNS组、FNS假刺激组和PI3K/Akt通道抑制剂LY294002组）。观察FNS以及LY294002对缺血后脑组织fibulin-5表达的影响，以及与血脑屏障通透性的关系。线栓法制备MCAO模型，电刺激小脑顶核及侧脑室PI3K/Akt通道抑制剂LY294002注射，EB测定BBB通透性，实时定量PCR测定fibulin-5mRNA表达规律，westernblot检测fibulin-5蛋白表达。结果：第一部分：①f ibulin-5主要表达在细胞外间质，也可在血管内皮细胞内表达；②E B含量测定显示，血脑屏障通透性从缺血再灌注6h时开始增加（8.63±1.03），再灌注24h（13.86±1.33）和48h（13.06±1.77）时达到高峰，72h时有所降低，但仍高于假手术组（10.66±1.47，P<0.05）,各缺血模型组与假手术组比较或者各模型组之间相比都有统计学差异（P<0.01，P<0.05）。③缺血再灌注大鼠脑组织fibulin-5mRNA表达从再灌注6h（1.22±0.03）开始升高，再灌注24h（1.48±0.05）达到高峰，48h（1.19±0.02）和72h（1.13±0.02）时有所降低，但仍高于假手术组（1.05±0.03，P<0.05）。各缺血组与假手术组相比有统计学意义，而假手术组与正常组相比没有明显统计学差异（P>0.05）。④相关性分析显示，缺血脑组织fibulin-5的表达与血脑屏障通透性有明显正相关（r=0.748，P<0.01）。⑤大鼠缺血侧脑组织fibulin-5蛋白表达从再灌注6h开始升高（1.26±0.46），再灌注24h（1.78±0.48）达到高峰，72h（0.89±0.27）时有所降低，但仍高于假手术组（0.30±0.14，P<0.05）。第二部分：①相对于IR模型组（13.68±1.51），FNS可以明显降低缺血脑组织EB含量（9.25±0.83，P<0.01），而FNS假刺激组与模型组比较，EB含量无统计学差异（13.47±1.44，P>0.05），这说明FNS可以降低BBB通透性的破坏，而LY294002干预组EB含量（16.93±0.44）明显高于模型组（13.68±1.51，P<0.01）；缺血模型组及各干预组与假手术组相比都有统计学意义（P<0.05）。②与IR模型组比较，FNS组明显上调fibulin-5mRNA的表达（1.62±0.02，P<0.01），FNS假刺激组无此效果(1.46±0.02, P>0.05),同时LY294002干预组（1.27±0.03）fibulin-5mRNA的表达有明显降低（P<0.01）；③大鼠脑组织fibulin-5蛋白表达与mRNA表达趋势相似，相对于IR模型组（0.45±0.03），FNS组fibulin-5蛋白表达有明显升高（0.66±0.07，P<0.05），而且FNS假刺激组fibulin-5的表达与模型组相比无明显统计学差异（0.43±0.05，P>0.05），LY294002干预组fibulin-5的表达明显降低（0.28±0.03，P<0.01）。结论：缺血再灌注大鼠缺血脑组织内fibulin-5mRNA及蛋白表达水平明显升高，并且与血脑屏障通透性有明显正相关性。FNS干预后缺血脑组织中fibulin-5的表达明显上调，并且血脑屏障通透性降低，同时PI3K/Akt通道抑制剂LY294002干预后fibulin-5表达降低，伴随血脑屏障通透性增加，说明fibulin-5对缺血后血脑屏障可能具有保护作用。