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研究背景及意义软骨组织的自我修复和再生能力极为有限,由各种因素所致的软骨组织缺损的修复一直是临床面临的巨大挑战。组织工程技术应用生物学和工程学原理,有望为受损软骨组织的再生提供先进的治疗策略,但目前该项技术尚未实现大规模的临床转化应用,主要瓶颈之一在于种子细胞来源问题。间充质干细胞是一类存在于多种组织的成体干细胞,因其具有多向分化潜能以及不涉及伦理问题而备受研究者青睐。其中,脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）因组织来源丰富、易获取及免疫原性低等优点已成为自体和同种异体干细胞治疗和组织工程重要的种子细胞来源。脂肪组织经酶消化后,得到的是基质血管成分细胞（stromal vascular fraction,SVF）。SVF不但包含ADSCs,还含有一定比例的内皮祖细胞、内皮细胞、造血细胞（包括造血干细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞）及周细胞等。相较于ADSCs,分离获取的SVF无需体外培养扩增,可实现一期手术自体回植,节省临床治疗时间。比较两者在体外三维条件下成软骨特性及体内构建可注射弹性软骨再生情况是否具有差异,将为以细胞治疗为基础的软骨组织工程技术提供理论基础,为弹性软骨构建中种子细胞的优化选择提供参考。研究目的1、从兔脂肪组织分离获得ADSCs和SVF,比较两者相关生物学特性,并对ADSCs进行鉴定,为体外及体内成软骨研究提供细胞源基础。2、通过组织学染色、基因表达检测以及组织糖胺多糖（glycosaminoglycan,GAG）定量分析等方面系统比较兔脂肪来源的ADSCs和SVF成软骨特性的差异,确立基于以上细胞的种子细胞应用策略,同时为组织工程弹性软骨构建中种子细胞的优化选择提供参考。研究方法1、应用胶原酶消化法和贴壁培养法分离纯化ADSCs,应用胶原酶消化法获取SVF,显微镜下观察两者的形态学特征;通过MuseTM细胞分析仪,比较两者的细胞活性;通过流式细胞分析,比较两者相关细胞表型表达差异,包括CD31、CD34、CD45、CD73、CD90 及 CD105,并应用 CD45-CD34+CD31-标记 SVF 中的 ADSCs亚群,以明确SVF中ADSCs细胞群所占比例。此外,对分离纯化的ADSCs进行成脂、成骨及成软骨诱导,结合细胞表面标志物表达情况等,进行干细胞特性的自我鉴定。2、应用胰酶结合胶原酶消化法分离兔耳廓软骨细胞（auricular chondrocytes,ACs）,将 ADSCs、SVF、ACs、ADSCs+ACs 及 SVF+ACs（共培养组细胞为 1:1 混合）在体外三维（pellet）培养条件下进行成软骨诱导,4周后,进行大体观察、组织学染色、tunel染色、Real-time PCR检测及GAG含量定量分析,比较ADSCs和SVF体外成软骨潜能。3、将Pluronic F-127凝胶负载的兔来源的ACs、ADSCs+ACs、SVF+ACs（共移植组细胞为1:1混合）植入裸鼠皮下,8周取材,进行大体观察、湿重检测、组织学染色、Real-time PCR成软骨相关基因检测及GAG定量分析,比较ADSCs和SVF分别与ACs共移植后体内可注射弹性软骨再生情况。研究结果1、倒置相差显微镜下观察ADSCs与SVF的细胞形态,可见ADSCs呈纺锤样（长梭形）,细胞形态均一;SVF呈悬浮状态,细胞大小不同。MuseTM细胞活性分析结果表明:ADSCs细胞活性高于SVF（ADSCs:94.87±1.652%;SVF:71.72±2.053%）。细胞流式分析表明:兔来源的ADSCs和SVF相关细胞表型表达存在差异。培养扩增的ADSCs高表达CD73和CD 105间充质干细胞标记物（CD73:88.07±5.444%,CD105:88.47±4.113%）,低表达 CD90 间充质干细胞标记物（CD90:23.43±6.647%）,阴性表达CD31内皮细胞/内皮祖细胞标记物、CD34干细胞标记物及CD45造血干细胞标记物（CD31:1.822±1.480%,CD34:1.935±0.1334%,CD45:2.105±0.9136%）;分离获取的 SVF,CD31、CD34、CD45、CD73、CD90及CD105标记物均有不同程度表达（CD31:33.97±4.246%,CD34:26.72±1.845%,CD45:20.97±3.260%,CD73:31.65±5.279%,CD90:41.98±7.238%,CD105:19.08±1.493%）,且 SVF 中 ADSCs 细胞群所占比例为9.947±1.072%。分离纯化的ADSCs可成功向脂肪、骨及软骨方向分化。2、ADSCs、SVF、ACs、ADSCs+ACs及SVF+ACs经过体外三维条件下成软骨诱导4周后,均可形成稳定的pellet。单独诱导组中,ADSCs组和SVF组比较,ADSCs组细胞外基质分泌情况优于SVF组,并且ADSCs组总GAG含量及GAG/DNA含量检测高于SVF组。在与ACs共培养中,组织学染色结果显示ADSCs+ACs组软骨基质分泌情况与SVF+ACs组比较,在pellet表层区无明显差异,而在pellet核心区和中间区,ADSCs+ACs组基质分泌情况明显优于SVF+ACs组。Real-time PCR软骨相关基因表达及GAG含量检测均为ADSCs+ACs组高于SVF+ACs组。Tunel染色结果表明ADSCs+ACs组细胞凋亡率在pellet表层区、中间区及核心区均显著低于SVF+ACs组。3、Pluronic F-127负载的ACs、ADSCs+ACs及SVF+ACs在裸鼠皮下均可形成软骨样组织,各组标本大小不等,SVF+ACs组湿重小于其余两组。组织学染色结果显示ADSCs+ACs组在标本边缘和中心部位基质分泌情况均优于SVF+ACs组。Real-time PCR结果显示ADSCs+ACs组ACAN和COMP的相对表达量高于SVF+ACs组,但COL2A1的相对表达量,两者无统计学差异。GAG定量检测结果显示ADSCs+ACs组GAG含量高于SVF+ACs组,且差异具有统计学意义。研究结论1、兔来源的ADSCs和SVF在细胞活性和相关细胞表型表达方面存在差异。纯化的ADSCs为细胞活性更高的均质性细胞群;分离获取的SVF为异质性细胞群,并且,纯化的ADSCs具有多向分化潜能。2、体外三维培养条件下,ADSCs、SVF、ACs、ADSCs+ACs及SVF+ACs均可在成软骨诱导液中,向软骨方向分化。ADSCs组的成软骨特性优于SVF组;且在与ACs共培养中,相较于SVF+ACs共培养组,ADSCs+ACs共培养组成软骨情况更佳。3、可注射材料Pluronic F-127凝胶负载的ADSCs+ACs体内弹性软骨再生情况优于SVF+ACs,可初步认为在与ACs裸鼠体内共移植（或体外共培养）时,相较于SVF,ADSCs可能是更为理想的种子细胞来源。但从应用便捷性等方面考虑,SVF仍然具有一定的临床应用优势。