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分化抑制因子(inhibitorofdifferentiation,Id),又称DNA结合抑制因子(inhibitorofDNAbinding),属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)转录因子家族成员之一,对碱性HLH(bHLH)转录因子活性起负调控作用,主要功能是抑制细胞分化、促进细胞增殖。哺乳动物细胞含四种Id分子(Id1～Id4)。Id3作为血清诱导的立即早期基因首先在小鼠成纤维细胞系中被发现,该分子参与多种细胞生物学过程,包括淋巴细胞发育、骨骼肌分化、血管平滑肌增殖、胚胎的神经形成和肿瘤诱导的血管发生等。
人Id3基因cDNA编码区基因全长360bp,编码产物含有119个氨基酸残基,分子量约13000。Id3在肿瘤细胞中的表达及其与肿瘤恶性程度的关系目前尚未得到一致性的结论。目前认为,Id3基因表达调控途径和机制的复杂性决定了其功能的多样性,Id3蛋白对细胞周期的调控具有细胞种类和阶段特异性。因此,探讨作为细胞调控蛋白的Id3分子在某些病理生理状态下的生理、生物学功能具有重要意义。在前期研究中我们发现,Id3基因在人肺腺癌细胞株A549细胞中呈低表达水平,将外源性Id3基因导入A549细胞过表达,可导致A549细胞生长抑制并诱导细胞凋亡。本课题构建并纯化了Id3重组腺病毒(Ad-Id3),观察Ad-Id3对裸鼠移植瘤作用的影响。将Id3基因克隆到质粒pUC18中构建重组质粒pUC18-Id3,pUC18-Id3经EcoRI和HindIII双酶切补平之后与粘粒载体pAxCAwrit连接,构建重组粘粒pAxCAwtit-Id3,使用包装试剂盒包装重组粘粒,转染大肠杆菌,鉴定正确后大量制备重组pAxCAwtit-Id3,经BspT1041酶切线性化后,用脂质体法转染HEK293A细胞,体内包装成重组腺病毒Ad-Id3,采用反复“感染-收集-冻融”法获取高滴度的重组腺病毒Ad-Id3,利用50％组织培养感染剂量法(TCID50)计算重组腺病毒滴度,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblot)法检测细胞内Id3基因和蛋白的表达。结果显示,Id3基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.8×1010pfu/mL,用RT-PCR检测到Id3基因的转录产物,Westernblot检测到Id3蛋白在A549细胞中的高水平表达。
为研究Id3转基因过表达对A549细胞体内致瘤作用的影响,将制备的Ad-Id3和空载体对照(Ad-LacZ)分别感染对数生长期的A549细胞,24h后将A549细胞、Ad-Id3感染的A549细胞和Ad-LacZ感染的A549细胞分别注入裸鼠皮下,建立裸鼠皮下肺腺癌移植瘤模型,比较该移植瘤与无Id3基因导入的A549细胞对照组移植瘤在小鼠体内生长的差异。每周观察一次小鼠皮下肿瘤生长情况,接种一个月后处死小鼠,摘除皮下肿瘤,游标卡尺测量肿瘤大小。采用RT-PCR和免疫组化技术检测各组肿瘤组织中Id3mRNA和蛋白表达的变化。结果发现,一个月后空白对照组和Ad-LacZ对照组移植瘤体积分别为142.18±54.52mm3和85.78±59.70mm3,Ad-Id3感染组移植瘤体积为2.22±0.70mm3,明显小于空白对照组和Ad-LacZ对照组(P＜0.05),Ad-LacZ对照组与空白对照组相比没有显著差异;RT-PCR结果显示Ad-Id3组肿瘤组织内Id3mRNA条带灰度值比值明显高于空白对照组和Ad-LacZ对照组(P＜0.01);免疫组化结果显示Ad-Id3组肿瘤组织内Id3蛋白表达程度明显高于空白对照组和Ad-LacZ对照组。以上结果提示Ad-Id3体外转染抑制了A549细胞的致瘤性生长,为研究腺病毒介导的Id3对基因治疗奠定了基础。