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背景：
苯是一种常见的工业化学品和普遍存在的环境污染物。慢性苯暴露可以影响造血系统并可能导致各种类型的白血病。苯是代谢活化性毒物，其氧化为活性中间体是产生血液毒性和骨髓毒性的先决条件，苯的活性代谢产物1,4-苯醌（1,4-benzoquinone，1,4-BQ）常被用作体外毒理学研究的受试物。已有研究表明，1,4-BQ可增加细胞内活性氧（ROS）水平，诱导线粒体损伤、细胞自噬和线粒体自噬，并最终导致细胞凋亡。虽然已有许多有价值的苯的毒理学研究报道，但苯的毒性机制还不十分清楚。
细胞内环境稳态在维持细胞的生理功能中起关键作用，细胞内pH是内环境稳态的关键特征之一。由于大多数生物反应都是pH依赖性的，并且许多蛋白质的功能对pH敏感，因此细胞内pH被严格控制在一定的生理范围内，受到多种质膜离子转运蛋白的严格调节，当这些蛋白的转运功能受到影响，细胞内pH将发生改变，并导致一系列有害细胞的分子事件发生。
细胞内酸化是pH调节失衡的重要特征之一。通常认为细胞内酸化是细胞凋亡的早期事件，并且提供允许凋亡执行的细胞内环境。也有研究表明，当细胞内发生酸化时，自噬和线粒体自噬被激活以应对酸化。然而苯暴露是否能诱导细胞内酸化尚未见报道，细胞内酸化在苯的毒性效应和机制中起什么作用还不得而知。因此，本研究的目的是探讨1,4-BQ能否诱导人早幼粒细胞白血病细胞HL-60发生细胞内酸化，以及细胞内酸化在ROS过量产生、自噬和凋亡中的作用和机制。
材料与方法：
以苯的活性代谢产物1,4-BQ为受试毒物，以人的急性粒细胞白血病细胞HL-60为细胞模型，实施体外毒理学研究。
1.BCECF-AM荧光分光光度法检测细胞内pH。
2.蛋白质免疫印迹法（WB）检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1、p62的表达及凋亡蛋白Cleavedcaspase9、Cleavedcaspase3的表达。
3.ROS检测试剂盒检测1,4-BQ处理对胞内ROS生成的影响。
4.AnnexinV-FITC/PI双荧光染料结合流式细胞术（FCM）定量评价1,4-BQ诱导的细胞凋亡。
结果:
1.1,4-BQ诱导细胞内酸化
用0、2.5、5.0、10、20、40μM浓度的1,4-BQ处理HL-60细胞3h，检测细胞内pH变化。结果显示：1,4-BQ可诱导细胞发生胞内酸化，且呈剂量依赖方式。用10μM1,4-BQ处理细胞，900s内连续检测胞内pH变化，结果显示：从暴露于1,4-BQ的可测量的最短时间开始细胞内pH值即出现下降，并呈时间依赖性。暴露时间15min~24h之间胞内pH值检测显示，在1~3h内细胞内pH值逐渐降低，而后恢复至正常水平。
2.NaOH阻断1,4-BQ诱导的细胞内酸化
为了评估1,4-BQ诱导的细胞内酸化和随后的细胞毒性事件之间的关系，我们用NaOH阻断1,4-BQ诱导的细胞内酸化。结果显示5μMNaOH是可以完全阻断1,4-BQ诱导酸化的最低实验浓度。
3.细胞内酸化与ROS之间的相互作用
由于1,4-BQ诱导的细胞内酸化和ROS过量产生都是早期发生的毒性效应，我们希望了解两者之间的关系。用NAC清除ROS检测细胞内酸化，用NaOH阻断细胞内酸化检测ROS含量。结果显示，NAC预处理阻断了1,4-BQ诱导的ROS的同时也纠正了细胞内酸化；NaOH阻断胞内酸化的同时也下调了ROS的过量产生。提示1,4-BQ诱导的细胞内酸化与ROS相互作用，互相影响，可能互为因果。
4.阻断酸化可以减少1,4-BQ诱导的自噬
为了探究1,4-BQ诱导的细胞内酸化在自噬中的作用，我们检测了1,4-BQ暴露的细胞在用或不用NaOH处理时的自噬水平。结果显示1,4-BQ处理的细胞增加了LC3-II/LC3-I比，以及Beclin1和p62蛋白表达，表明自噬被1,4-BQ的暴露激活。然而，当1,4-BQ诱导的酸化被NaOH阻断时，LC3-II/LC3-I比、Beclin1、p62蛋白的表达均减少，表明阻断细胞内酸化可以抑制1,4-BQ诱导的自噬。
5.阻断酸化可以降低1,4-BQ诱导的凋亡
为了探究1,4-BQ诱导的细胞内酸化在凋亡中的作用，我们检测了在用或不用NaOH的情况下，1,4-BQ处理的HL-60细胞中的细胞凋亡的变化。结果显示，阻断胞内酸化可降低1,4-BQ诱导的细胞凋亡率，以及caspase9和caspase3的表达水平。表明阻断1,4-BQ诱导的胞内酸化可以减少细胞凋亡。
结论:
苯的活性代谢物1,4-BQ能够诱导HL-60细胞发生细胞内酸化，其诱导的细胞内酸化和ROS相互作用、互相影响，细胞内酸化介导了1,4-BQ诱导的自噬和细胞凋亡。
苯是一种常见的工业化学品和普遍存在的环境污染物。慢性苯暴露可以影响造血系统并可能导致各种类型的白血病。苯是代谢活化性毒物，其氧化为活性中间体是产生血液毒性和骨髓毒性的先决条件，苯的活性代谢产物1,4-苯醌（1,4-benzoquinone，1,4-BQ）常被用作体外毒理学研究的受试物。已有研究表明，1,4-BQ可增加细胞内活性氧（ROS）水平，诱导线粒体损伤、细胞自噬和线粒体自噬，并最终导致细胞凋亡。虽然已有许多有价值的苯的毒理学研究报道，但苯的毒性机制还不十分清楚。
细胞内环境稳态在维持细胞的生理功能中起关键作用，细胞内pH是内环境稳态的关键特征之一。由于大多数生物反应都是pH依赖性的，并且许多蛋白质的功能对pH敏感，因此细胞内pH被严格控制在一定的生理范围内，受到多种质膜离子转运蛋白的严格调节，当这些蛋白的转运功能受到影响，细胞内pH将发生改变，并导致一系列有害细胞的分子事件发生。
细胞内酸化是pH调节失衡的重要特征之一。通常认为细胞内酸化是细胞凋亡的早期事件，并且提供允许凋亡执行的细胞内环境。也有研究表明，当细胞内发生酸化时，自噬和线粒体自噬被激活以应对酸化。然而苯暴露是否能诱导细胞内酸化尚未见报道，细胞内酸化在苯的毒性效应和机制中起什么作用还不得而知。因此，本研究的目的是探讨1,4-BQ能否诱导人早幼粒细胞白血病细胞HL-60发生细胞内酸化，以及细胞内酸化在ROS过量产生、自噬和凋亡中的作用和机制。
材料与方法：
以苯的活性代谢产物1,4-BQ为受试毒物，以人的急性粒细胞白血病细胞HL-60为细胞模型，实施体外毒理学研究。
1.BCECF-AM荧光分光光度法检测细胞内pH。
2.蛋白质免疫印迹法（WB）检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1、p62的表达及凋亡蛋白Cleavedcaspase9、Cleavedcaspase3的表达。
3.ROS检测试剂盒检测1,4-BQ处理对胞内ROS生成的影响。
4.AnnexinV-FITC/PI双荧光染料结合流式细胞术（FCM）定量评价1,4-BQ诱导的细胞凋亡。
结果:
1.1,4-BQ诱导细胞内酸化
用0、2.5、5.0、10、20、40μM浓度的1,4-BQ处理HL-60细胞3h，检测细胞内pH变化。结果显示：1,4-BQ可诱导细胞发生胞内酸化，且呈剂量依赖方式。用10μM1,4-BQ处理细胞，900s内连续检测胞内pH变化，结果显示：从暴露于1,4-BQ的可测量的最短时间开始细胞内pH值即出现下降，并呈时间依赖性。暴露时间15min~24h之间胞内pH值检测显示，在1~3h内细胞内pH值逐渐降低，而后恢复至正常水平。
2.NaOH阻断1,4-BQ诱导的细胞内酸化
为了评估1,4-BQ诱导的细胞内酸化和随后的细胞毒性事件之间的关系，我们用NaOH阻断1,4-BQ诱导的细胞内酸化。结果显示5μMNaOH是可以完全阻断1,4-BQ诱导酸化的最低实验浓度。
3.细胞内酸化与ROS之间的相互作用
由于1,4-BQ诱导的细胞内酸化和ROS过量产生都是早期发生的毒性效应，我们希望了解两者之间的关系。用NAC清除ROS检测细胞内酸化，用NaOH阻断细胞内酸化检测ROS含量。结果显示，NAC预处理阻断了1,4-BQ诱导的ROS的同时也纠正了细胞内酸化；NaOH阻断胞内酸化的同时也下调了ROS的过量产生。提示1,4-BQ诱导的细胞内酸化与ROS相互作用，互相影响，可能互为因果。
4.阻断酸化可以减少1,4-BQ诱导的自噬
为了探究1,4-BQ诱导的细胞内酸化在自噬中的作用，我们检测了1,4-BQ暴露的细胞在用或不用NaOH处理时的自噬水平。结果显示1,4-BQ处理的细胞增加了LC3-II/LC3-I比，以及Beclin1和p62蛋白表达，表明自噬被1,4-BQ的暴露激活。然而，当1,4-BQ诱导的酸化被NaOH阻断时，LC3-II/LC3-I比、Beclin1、p62蛋白的表达均减少，表明阻断细胞内酸化可以抑制1,4-BQ诱导的自噬。
5.阻断酸化可以降低1,4-BQ诱导的凋亡
为了探究1,4-BQ诱导的细胞内酸化在凋亡中的作用，我们检测了在用或不用NaOH的情况下，1,4-BQ处理的HL-60细胞中的细胞凋亡的变化。结果显示，阻断胞内酸化可降低1,4-BQ诱导的细胞凋亡率，以及caspase9和caspase3的表达水平。表明阻断1,4-BQ诱导的胞内酸化可以减少细胞凋亡。
结论:
苯的活性代谢物1,4-BQ能够诱导HL-60细胞发生细胞内酸化，其诱导的细胞内酸化和ROS相互作用、互相影响，细胞内酸化介导了1,4-BQ诱导的自噬和细胞凋亡。