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目的多药耐药（multidrug resistance,MDR）的产生可以使多种肿瘤细胞对化疗药物产生交叉耐药性是白血病化疗失败的原因。MDR产生的机制是较复杂,其中P-170蛋白（P-gp）是一个重要的机制,P-gp是一种能量依赖的膜溢泵,减少肿瘤细胞内多种结构各异的药物浓度。P-gp调节剂具有恢复肿瘤细胞对化疗药物敏感性的作用。宿主的遗传性或者后天的变化都可以引致获得性耐药的产生。另外,参与凋亡调控的一些信号传导途径和药物代谢酶的改变也可以引起肿瘤细胞的MDR。这些在耐药的研究中日益受重视。鼠尾草酸（Carnosic acid,CA）是迷蝶香（Rosmarinus officinalis L）提取物中的抗氧化多酚,具有多种药理作用,如;抗氧化、抗肿瘤、抗血栓、抗炎等。CA还可有效抑制金葡菌多药耐药溢出泵的作用来调节细菌的MDR,因此CA是否具有逆转肿瘤细胞耐药的作用呢?本实验探讨了CA对体外培养的人类红白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/AO2多药耐药的逆转作用,采用分子生物学技术及人基因芯片研究人类髓性白血病发生的分子途径,有助于揭示白血病发生的共同机制,并探讨其发挥作用的分子途径和相关机制。方法选用K562/AO2多药耐药细胞系为研究对象,采用MTT法确定CA及VRP的非细胞毒性剂量;取低于10%抑制浓度(inhibiting concentration,IC10)作为药物作用浓度;CA 25μmol/L。在此浓度逆转剂作用下测定阿霉素（Adriamycin,ADM）对K562及K562/AO2细胞的半数抑制浓度(IC50),以此判断CA对耐药细胞药物敏感性的影响。以流式细胞仪（Flow cytometry FCM）和激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy LSCM）测定CA用药前后细胞内ADM荧光强度的变化,并通过LSCM得到ADM荧光强度和浓度之间的线性关系,由此得到相应的细胞内ADM浓度。通过LSCM观测ADM在K562/AO2细胞内亚细胞分布。流式细胞术检测逆转剂作用前后K562/AO2细胞膜P-gp表达的情况。采用半定量逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）检测多药耐药基因mdr1及凋亡相关基因bcl-2/bax的mRNA表达。采用Western-blot方法检测CA处理前后P-gp蛋白在K562/AO2细胞中的表达。用CA处理过的K562/AO2细胞与空白的K562/AO2细胞的mRNA进行实时定量RT-PCR药物代谢基因芯片及Oligo信号传导基因芯片,以探讨CA对K562/AO2细胞中产生多药耐药的相关基因的影响。结果K562/AO2细胞对ADMIC50为16.31μg/mL,加入CA后降至1.35μg/mL,逆转倍数为12.08,与加逆转剂之前相比具有显著性差异（P＜0.01）。流式细胞仪检测结果表明K562/AO2细胞内ADM荧光强度为17.05,加入CA后,细胞内ADM荧光强度增至60.53,与加入逆转剂之前相比具有显著性差异（P＜0.01）,通过LSCM可得到不同浓度的ADM荧光强度（y）和浓度（x）的线性方程为Y=8.47×10-3X-1.34,根据LSCM检测得到的CA处理后的K562/AO2细胞内ADM荧光强度可以得出细胞内ADM的浓度,CA可将K562/AO2细胞内ADM浓度由4.86μg/mL升至15.56μg/mL,与加逆转剂之前比较有显著性差异（P＜0.05）。ADM在K562细胞内呈弥漫性分布,而在K562/AO2细胞内主要分布在细胞核周和膜周的区域,经CA处理后,可恢复ADM在K562/AO2内细胞核和胞浆中的弥漫分布,且可增加细胞内ADM的聚集。流式细胞仪检测K562/AO2细胞膜上P-gp表达的荧光强度为44.40,加入逆转剂CA后,细胞膜上P-gp的荧光强度降至23.80,加药前后有显著性差异（P＜0.05）。RT-PCR结果显示CA可降低mdr1及抗凋亡基因bcl-2的表达,bax的表达较加药前增加,bcl-2/bax的比值降低,加药前后其灰度值有显著性差异（P＜0.01）。Western blot结果显示P-gp在K562/AO2细胞内呈现高表达,而在K562细胞内几乎没有表达,在K562/AO2细胞内加XCA后,P-gp的表达明显降低。在药物代谢芯片的实验中,我们确定了与耐药有关的药物代谢酶;基因表达上调2倍的基因有35个,表达下调2倍的基因有7个。糖代谢是能量代谢的核心组成部分,糖代谢异常与许多重大疾病有密切的关联。糖酵解是肿瘤代谢的主要方式,因此糖酵解过程中的关键酶;己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）,丙酮酸激酶（PK）在白血病诊疗中有重要的作用。CA可以抑制糖酵解途径的关键酶的表达使肿瘤细胞内糖酵解终止,抑制肿瘤细胞中的能量代谢,使肿瘤细胞由于内能的缺乏而促使肿瘤细胞凋亡。在信号转导药物芯片实验中,CA可以作用于与肿瘤MDR有关的信号转导通路中的一些主要的调控分子逆转白血病MDR,与多个信号传导过程有关。表达上调2倍以上的基因有25个,其中有显著意义的基因有p300/CBP,IL-4R,IRF-1,TP5313,NFKIB和v-fos等,这些基因在细胞周期调控、细胞分化和细胞凋亡等多种生理过程中发挥着重要作用。CA可引起多个信号通路的改变;p53信号通路,TGF-β信号通路,STAT通路,NF-κB信号通路及MAPK通路等,这些信号通路与肿瘤细胞的增殖和凋亡有密切关系,可能参与可肿瘤的化疗耐药。结论在体外,CA可以增加细胞内ADM的浓度、提高耐药细胞对ADM的敏感性、下调多药耐药基因mdr1mRNA的表达,并在下调抗凋亡基因bcl-2 mRNA的同时上调促凋亡基因bax mRNA的表达,并可以降低P-gp蛋白的表达。上述结果表明CA可以通过抑制P-gp的功能和表达达到逆转耐药的目的,以及调节抗凋亡基因bcl-2与促凋亡基因bax诱导细胞凋亡。CA还可以抑制肿瘤的能量来源—糖酵解途径的关键酶诱导细胞凋亡,同时可以通过改变信号转导通路中重要的调控分子引起细胞的分化和凋亡,达到杀死肿瘤细胞的目的。由上述结果可以得知CA作为一种新的,对细胞无毒性作用的MDR的调节剂,可有效的在体外逆转人白血病细胞K562/AO2细胞的多药耐药性。