研究背景及目的：煤工尘肺（Coal worker’s pneumoconiosis，CWP）是我国我省重要的职业病之一，由于其导致的严重呼吸功能障碍可对脑功能产生不利影响，已日益受到社会的重视。研究探讨煤工尘肺对脑功能影响的原因和机制，有重要的临床价值，也是我们医学界义不容辞的责任。研究显示，随着煤工尘肺的晋级，肺功能正常率降低，肺功能障碍的危险性第次增加，常常引起与肺脏损害不成比例的更加严重的肺功能障碍，而持续的低氧血症和高碳酸血症，将引起呼吸系统以外多器官系统的损伤，中枢神经系统的影响尤为明显，早期即可引起学习力、记忆力、计算力等认知功能的改变，但其发生机制尚不完全清楚。内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞中蛋白质合成、修饰、装配折叠以及Ca2+储存的重要细胞器，近年来，其在维持细胞稳态、影响细胞存亡的作用业已日益引起广大学者的高度重视。有相关研究发现，内质网功能紊乱，如葡萄糖缺乏、Ca2+稳态改变、自由基损伤等导致蛋白质在内质网中错误折叠和积聚从而引发的内质网应激反应可以导致特异性的细胞凋亡，被认为是继死亡受体和线粒体途径之后的第三条细胞凋亡途径。诱发内质网应激（endoplasmicreticulum stress，ERS）的理化因素包括缺血、低氧、氧化应激、紫外线、营养物质不足、病毒、毒性物质、高同型半胱氨酸血症等，这些因素可以分别通过不同机制引发内质网应激。内质网应激一方面可以通过各种途径使细胞蛋白质合成水平下降、内质网伴侣蛋白表达上调，提高细胞对各种刺激的抵抗能力，帮助细胞尽快恢复稳态；另一方面，当刺激因素持续存在或强度过大，内质网应激的保护性反应不足以恢复细胞常态时，将启动程序性细胞凋亡途径，导致细胞凋亡。煤工尘肺形成后导致的长期、慢性缺氧，是重要的内质网应激激发因素。通过激活神经细胞的内质网应激反应，，继而激活经由以caspase-12为起始因子和以CHOP信息分子为中心的细胞凋亡途径，导致的神经细胞凋亡，很可能是引起脑功能障碍的重要机制。我们导师牛小媛教授领导的研究团队，在煤工尘肺与脑功能改变领域做了有意义的探索，已经发现煤工尘肺患者认知功能障碍的发病率较高，并进行了系列的动物实验研究。本项研究以内质网应激理论为指导，通过成功复制煤工尘肺引发认知功能障碍的大鼠模型，探讨煤工尘肺对认知功能影响的发病机制，为临床诊断和治疗提供新思路和新策略。本项研究共分两部分：第一部分，主要建立大鼠煤工尘肺以及对学习记忆功能影响的动物模型；第二部分，重点探讨内质网应激在煤工尘肺大鼠认知功能障碍发病中的作用。第一部分煤工尘肺对学习记忆功能影响的动物模型的建立研究方法：雄性Wistar大鼠100只,体重180～200g。取晋城市矿务局一级无烟煤研磨粉碎，200目钢网过滤、水选，用生理盐水配成50g/L的悬液，高压灭菌后备用。选择18号静脉套管针制备气管导管。捕捉大鼠，腹部消毒，用10％水合氯醛（300 mg/kg.w）经腹腔麻醉后仰卧固定，直接经口气管插管，确定导管在气管内后，模型组动物灌入煤尘生理盐水悬液（1ml/只大鼠），正常对照组动物灌入等量生理盐水。实验初始时灌注1次。全部实验动物在同等条件下饲养并自由饮食。分别在实验8周末和20周末，随机各抽取实验组与对照组大鼠20只，应用Morris水迷宫系统分别测定其学习和记忆能力。随后无菌操作，抽取腹主动脉血进行血气分析，摘取肺组织和脑组织，用于形态学观察。研究结果：1、Morris水迷宫定位航行试验和空间探索试验结果表明，模型组大鼠的学习能力和记忆能力明显受损，并与染尘时间相关。2、经气道灌注煤尘动物随着染尘时间延长，动脉血氧分压（PaO2）逐渐降低，PaCO2逐渐升高，说明实验组动物染尘后肺功能逐渐降低，并且与染尘时间有关。3、肺组织胶原纤维（Van Gieson，VG）染色结果表明，肺组织纤维化指数随病程进展显示出明显增高性变化，说明染尘是引起肺组织发生纤维化的重要因素。4、肺组织病理形态学变化：光学显微镜下观察发现，染尘8周可见肺组织中有大量煤尘沉积，间质和肺泡区炎性反应，肺间质出血，部分肺泡腔中有均匀的蛋白水肿液，肺组织有破坏，间质纤维组织增生，部分区域可见代偿性肺气肿；染尘20周大鼠仍有大量煤尘沉积，可见吞噬了煤尘的巨大体积的巨噬细胞，水肿，病变区域肺泡壁增厚，间质纤维组织增生明显；代偿性肺气肿区域肺泡壁破坏，或者明显被挤压；可见多个煤尘结节。5、脑组织病理形态学变化：光学显微镜下观察发现，8周时间点炎性反应明显，总体表现为血管扩张、充血，胶质细胞增多，间质疏松、神经细胞突起和核仁消失，提示脑组织有水肿和神经细胞变性；部分神经元核染色质浓缩，可见少量凋亡小体。20周时间点可见神经细胞变性加重，核膜增厚，染色质凝集成块状，核固缩更加明显，凋亡小体较8周时间点增多；间质有筛网状结构，提示有局灶性液化性坏死，可见核碎裂和坏死细胞。6、脑组织神经特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）染色计数表明，NSE高特异性的定位于神经元，煤工尘肺组的神经细胞数量较对照组明显减少，提示了其导致认知功能障碍的重要机制。第二部分内质网应激在煤工尘肺大鼠认知功能障碍发病中的作用研究方法：雄性Wistar大鼠,体重180～200g,山西医科大学动物中心提供。适应性饲养一周后，模型组经气管灌入煤尘生理盐水悬液（50g/L）lml/只，对照组灌入生理盐水1ml/只。实验初始时灌注1次。全部实验动物在同等条件下饲养并自由饮食。染尘后8周末，动物经10％水合氯醛（300 mg/kg·w）腹腔注射麻醉，将脑组织取出，部分组织液氮冻存，制作匀浆，采用生物化学法检测丙二醛（MDA）含量；部分组织于10％的中性甲醛固定，用于组织学研究。采用免疫组织化学染色方法，观察HIF-1α、GRP78、CHOP、caspase-12、Bcl-2的蛋白表达，在光学显微镜下，使用BI2000显微图像分析系统对阳性染色面积进行半定量分析；采用TUNEL法，进行凋亡细胞染色，同样使用BI2000显微图像分析系统计数阳性染色细胞。研究结果：与正常对照组相比较，模型组MDA含量、HIF-1α、GRP78、CHOP、caspase-12、Bcl-2的蛋白表达量均明显增加，凋亡细胞阳性率显著升高。形态学也观察到明显增加的凋亡征象，充分说明煤工尘肺8周大鼠发生的低氧血症，引发了脑组织的内质网应激反应，并引起了神经细胞凋亡。综合上述研究结果，本项研究的意义在于：（1）成功复制了煤工尘肺导致认知功能障碍的大鼠模型，为研究CWP大鼠神经细胞数量减少奠定了良好的实验基础；（2）深入探讨了内质网应激机制在认知功能障碍发病中的作用。