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三聚氰胺(Melamine)是一种重要的化工原料,由于其含氮量高达66%,且价格低廉,曾被一些不法商贩冒充蛋白质掺杂到乳制品中以提高氮含量。通常,摄入的大约90%三聚氰胺可由肾脏排出;但摄入量过多时,三聚氰胺与三聚氰酸结合形成无法溶解的氰尿酸三聚氰胺结石,可能导致肾脏和泌尿系统的疾病,危害身体健康。因此,开发和建立三聚氰胺检测方法已成为了当前食品领域中研究的热点之一。目前,国内外已开展了HPLC、LC-MS、GC-MS、CE等和适体传感器、比色传感器、电化学生物传感器等方法检测三聚氰胺含量的研究。为进一步开发简单快速、灵敏度高、特异性强的三聚氰胺检测技术,本论文拟基于三聚氰胺与胸腺嘧啶(T)以氢键特异性结合的原理,设计和筛选出富含T的DNA探针,通过分析DNA-三聚氰胺复合物产生的阻滞电流信号,建立了纳米孔单通道记录检测三聚氰胺的方法,并将其应用于奶制品中三聚氰胺的检测,为高灵敏度和特异性地检测食品中三聚氰胺的含量提供一定的技术支持。主要研究结果如下:(1)构建了特异性检测三聚氰胺的纳米孔单通道记录检测体系。选用α-溶血毒素蛋白纳米孔,从设计的6条DNA探针中筛选出了与三聚氰胺特异性结合的DNA1——(C)30(T)20;在优选的温度27℃、时间1 h和添加buffer(0.1 M PB,0.3 M NaCl)等条件下,三聚氰胺与DNA探针孵育后产生的特征信号的频率最高,可用于后续三聚氰胺检测的研究。(2)研究了三聚氰胺与DNA探针的结合方式以及其检测原理。研究发现,三聚氰胺的浓度直接影响了其特征信号的阻滞电流幅度;其中,三聚氰胺的浓度在0.1-50μM范围时与两条单链DNA形成DNA-Melamine复合物,而浓度在50-200μM时与三条单链DNA结合形成DNA-Melamine复合物。当以上不同构型的DNA-Melamine复合物进入蛋白纳米孔时,未解链成单链穿过纳米孔,而是停留在蛋白纳米孔中,产生了不可逆的电流下降,从而实现对三聚氰胺的检测。(3)基于建立的纳米孔单通道记录检测体系,开展了在缓冲液和鲜牛奶样品中三聚氰胺的定性和定量检测。在缓冲液体系中,三聚氰胺的浓度在1-100μM范围内,与特征“堵塞”信号的时间具有良好的线性关系,线性相关系数R2为0.9901,检测限为100 nM;在鲜牛奶样品体系中,三聚氰胺的浓度在10-90μM区间内,与特征“堵塞”信号的时间成线性关系,相关系数R2为0.9801,检测限为1μM;同时,鲜牛奶中可能存在的乳糖、金属离子(Mg~2+、Ca~2+、Fe~3+、Cu~2+、Zn~2+)和Vc以及三聚氰胺结构类似物(三聚氰酸、赖氨酸、半胱氨酸)均未对三聚氰胺检测结果产生干扰,表明该纳米孔单通道检测体系对三聚氰胺的检测具有良好的灵敏度和特异性。