背景及目的：目前，再灌注治疗成为急性心肌梗死的重要治疗方法，然而大量临床病历显示，缺血后濒危心肌恢复血供反而会加重心肌损伤，如何使损伤坏死心肌得到修复已成为当前一项重要的研究内容，也是今后心血管研究的发展趋势之一。近年来，伴随着分子生物学技术的进步及干细胞研究的突破性进展，为冠心病、心梗及缺血再灌注损伤的防治带来了新的希望。通过特定的分化步骤，间充质干细胞可以被诱导分化为多种成熟的靶细胞，已经成为了公认的成人干细胞移植的来源之一，并被用于多种研究，包括心肌梗死后再修复，同时显示出提高急性或慢性心肌缺血的患者心肌再灌注和心功能的能力。然而从骨髓、胚胎或者成体组织中分离培养的间充质干细胞存在很多缺点，因此寻找新的优良干细胞成为了细胞治疗研究的焦点。羊水间充质干细胞作为一种新的优良种子细胞，为心肌的修复和再生带来了新的希望。关于羊水间充质干细胞的诱导分化研究目前还处于起步阶段，国内外相关的研究不多。因此，如何高效地使羊水间充质干细胞定向分化为心肌细胞成为了心血管再生医学研究的焦点之一。5-氮胞苷可以促进心肌细胞肌小节的生成，还可以促进心肌细胞特有的肌球蛋白和肌间蛋白的生成，转录生长因子β1是多功能生长因子家族，与增殖、分化和死亡等多种细胞应答有关，在干细胞自我更新、修复中起关键作用。本研究将改变传统的诱导分化方法，尝试采用5-氮胞苷和转录生长因子β1联合诱导羊水间充质干细胞进行分化，从而提高羊水间充质干细胞的分化效能。方法：根据前期成功分离培养羊水间充质干细胞的实验方法，抽取怀孕16-18天的新西兰白兔的羊水培养羊水间充质干细胞，使用Western blot检测干细胞全能基因OCT4的表达，取表达阳性细胞制成细胞悬液注射到BALB/C品系裸鼠皮下进行致瘤实验，分为对照组和实验组，至少观察8周。将干细胞全能基因OCT4表达阳性的羊水间充质干细胞分为A、B、C和D组，即A：对照组，B：转录生长因子β1诱导分化组，C：5-氮胞苷诱导分化组，D：5-氮胞苷与转录生长因子β1联合诱导分化组。A组不作处理，B组加入浓度为5ng/ml的转录生长因子β作用24小时，C组加入浓度为10μmol/L的5-氮胞苷作用24小时，D组加入浓度为5ng/ml的转录生长因子β1和浓度为10μmol/L的5-氮胞苷作用24小时后更换培养液，并分别在诱导后1、2、3和4周时，使用Real time PCR检测心肌转录因子GATA4的表达，免疫荧光法检测心肌特异性肌钙蛋白cTnT，western blot检测缝隙连接蛋白Cx43，收集各项指标表达升高组的细胞，制作细胞切片，使用透射显微镜观察细胞的超微结构的变化。结果：1.经检测，羊水间充质干细胞的干细胞全能基因OCT4蛋白呈阳性表达。2.致瘤实验显示对照组和实验组的裸鼠8周后均正常生活，注射部位未见肿瘤形成。3.培养的羊水间充质干细胞分组经诱导分化后，A组细胞长势无明显变化，4周内传代6次后形态仍保持长梭形；B组细胞加入TGFβ1后生长增快，形态较A组伸长；C组加入5-氮胞苷后细胞形态变长，部分融合；D组加入TGFβ1和5-氮胞苷后细胞部分融合，形态伸展变得粗大。4. Real time PCR检测各组心肌细胞特异性转录因子GATA4的表达：A组在4周内无明显升高，B组在第4周时表达升高，C组在第3周时表达升高，D组在第2周时表达明显升高，其中D组表达水平最高，与其余三组比较差别有统计学意义。5.免疫荧光法检测各组细胞诱导分化后心肌肌钙蛋白cTnT的表达：结果显示在第2周时A组只有极少量表达，B组和C组表达量略有增加，而D组心肌肌钙蛋白cTnT表达水平明显高于A组、B组和C组，差别有统计学意义。6. Western Blot法检测各组细胞诱导分化后缝隙连接蛋白Cx43表达：在诱导分化后第2周时，A组只有极少量表达，B组和C组表达量略有增加，而D组缝隙连接蛋白Connexin43的表达比A组、B组和C组明显增加，差别有统计学意义。7.透射电镜检测各组细胞诱导分化后的细胞超微结构的变化：D组细胞可观察到部分细胞有心肌细胞特异性的肌丝样结构。结论：我们的研究结果表明：1.采用我们的实验方法和条件分离出来的羊水间充质干细胞，干细胞全能基因OCT4蛋白呈阳性表达，结果表明羊水间充质干细胞是一种多能干细胞。另外，本研究的致瘤实验证明羊水间充质干细胞不具有致瘤性。2.羊水间充质干细胞经过诱导分化后的部分细胞中，心肌细胞特异性的GATA4、心肌肌钙蛋白cTnT和缝隙连接蛋白Cx43蛋白表达都呈阳性，而且电镜下可见心肌细胞特异性的肌丝样结构，表明分化后的部分细胞已经具有心肌细胞的特性，已经转化为心肌样细胞。各项检测指标在5-氮胞苷和转录生长因子β联合诱导组中的表达水平较其他组的表达水平明显升高，结果表明联合诱导羊水间充质干细胞分化为心肌样细胞更加高效。3.本实验成功提供了羊水间充质干细胞在体外定向分化为心肌样细胞的高效可行方案，为心肌细胞的修复和再生带来了新的希望。