【背景】正常皮肤代谢更新以及皮肤内各种细胞的增殖凋亡和功能行使共同构成皮肤的稳态,这种稳态受到体内各种信号的调节。一旦稳态被破坏,机体会调动包括免疫细胞、干细胞、成纤维细胞等等在内的力量加以恢复。在这一过程中,如果各种因素不能得到有效协调,则会发生迁延不愈的疾病或者异常的愈合。比较典型的例子就是全层皮肤创伤后的炎症以及异常愈合造成的瘢痕。深达真皮层的皮肤创伤不能在短时间内愈合,较为剧烈炎症反应给皮肤闭合造成困难,对于免疫力低下的人群,长期不愈的慢性炎症容易诱发其他疾病。真皮的成纤维细胞在持续的炎症或其他因素的刺激下,过度增殖,导致胶原的无序积累,在愈合过程中造成瘢痕。由此可见,对炎症水平的有效调节,是促进全层皮肤创伤正常愈合的关键问题;而对成纤维细胞增殖和胶原代谢的有效控制,则是抑制瘢痕发生的关键问题。目前,关于皮肤创伤,特别是全层创伤愈合与瘢痕控制的相关疗法,也主要是从以上问题入手的。基于再生医学的发展和对小分子化合物生物性能的研究深入,利用干细胞和小分子药物已成为两类疾病治疗的发展方向。诸多研究已经表明,间充质干细胞趋化到创伤部位,可以发挥免疫调节能力和促进组织再生的能力。前一种能力的发挥有赖于MSC分泌的一系列细胞因子和表面表达的FasL以及包浆内表达的iNOS;而促进再生能力的途径则众说纷纭,有研究报道msc在创伤部位分化多种谱系的细胞,有的研究则报道msc分泌一系列细胞因子促进组织细胞增殖分化。但是,这两种能力的发挥都有赖于msc趋化到创伤部位定植。黄酮类小分子化合物现已成为再生医学的研究热点。表现出许多优良的性质,例如白藜芦醇、雷帕霉素等对细胞能量代谢的调节,对细胞周期以及干细胞多向分化能力的调节等等。本课题组前期研究发现,黄酮类化合物山萘酚能够对人类表皮细胞的生物学性质产生良好的作用,有效的维护表皮细胞稳态。因此,本课题决定开展山萘酚对真皮生物学性质作用的研究,重点放在山萘酚在真皮失稳时对皮肤细胞的稳态恢复的作用上。【目的】观察和研究kf对真皮稳态的维持作用,研究kf对真皮多能干细胞和成纤维细胞基本生物学行为的改变并探索其机理;探索kf通过msc影响皮肤稳态的机制和kf抑制hsfb生长的机制,为药无治疗瘢痕的提供新的依据。【方法】1.分离培养和鉴定小鼠bmmsc和真皮fb,以及hsfb,并用mtt、cfu和流式实验探索kf对这些细胞体外培养的影响与作用,同时摸清kf对每种细胞的作用敏感浓度;通过在划痕实验中引入条件培养液,探索kf对msc和fb以及msc与fb在kf存在下的相互作用关系;2.建立无创和全层皮肤创伤模型,通过干细胞静脉移植和免疫荧光探索kf局部作用于真皮对小鼠bmmsc趋化的作用;通过pcr和体外共培养探索小鼠bmmsc在kf作用下免疫抑制能力的变化和机制,将在体外用kf处理的msc移植到小鼠创面,实践研究kf对msc免疫抑制作用对皮肤稳态的影响;3.采用体外培养和分子生物学技术,探索kf对体外培养的hsfb生长抑制作用的机理;建立兔耳瘢痕模型,利用组织学技术和pcr实验,探索kf局部用药对瘢痕的抑制效应和炎症的降低作用。【结果】1.通过体外分离培养,获得了小鼠真皮成纤维细胞、骨髓间充质干细胞和人源增生性瘢痕成纤维细胞。作为后期研究的基础,我们首先选择了增殖和迁移(归巢)能力作为kf调控细胞行为的基础现象加以收集。通过反复利用mtt实验,我们基本摸清了kf在体外对小鼠msc和fb的作用敏感浓度n(0.25×10-5m/l),并用已经报道的kf对msc分化功能的影响证实了该浓度作用细胞的可行性,以及这种浓度下两类细胞增殖能力受到的影响:kf促进msc增殖而抑制fb增殖。流式细胞结果显示,两种细胞在kf的作用下g1/g0期细胞比例发生不同改变,提示这种对增殖能力的调控并非通过诱导过多细胞凋亡,而是通过调整正常的细胞周期分布比重来实现的。我们在划痕中引入了条件培养液来探索msc和fb的相互作用。结果表明,(kf+fb)条件培养液与kf相比对msc的迁移并无显著差异,而(dmso+fb)条件培养液作用下,msc的迁移效率降低,结合mtt结果,显示在fb增殖受到抑制时,它对皮肤msc的归巢没有影响,而当fb抑制作用消失时,它却并不促进msc的归巢。相比msc,fb的迁移主要发生在皮肤创面或炎症区域内,而其受到来自msc或其他细胞的影响也更加复杂,所以在fb的划痕中我们模拟了更多的体内情况。结果显示,年轻小鼠bmmsc的条件培养液(yb-cm)并不抑制fb的迁移,重要的是,kf所带来的迁移抑制作用可以被yb-cm所中和;衰老bmmsc的条件培养液并不促进fb的迁移,在kf存在下这种效应也没有改变。探索kf对人来源的增生性瘢痕成纤维细胞(hsfb)的增殖能力的影响的结果表明,kf在体外也可以抑制hsfb的生长,提示我们kf治疗人类皮肤瘢痕的线索。2.利用体内试验证实了kf能在真皮中形成诱导骨髓间充质干细胞归巢的微环境。在此我们尝试参照已被报道的msc趋化因子对涂抹kf的皮肤rna进行了pcr检测,但是并未发现有特异的高表达趋化因子,因此暂不对这种微环境的具体成因和其趋化因子进行深入探讨。而将主要精力放在归巢msc对皮肤的作用上。我们构建了较为成熟的小鼠全层皮肤创面模型,并证实了在创伤模型中,kf也能发挥趋化更多msc到达创面的作用,而且创面炎症状态也随着kf的到来有所缓和。证明了小鼠bmmsc也能在kf作用下上调fasl的表达,并且这是造成kf处理的msc免疫抑制能力增强的原因。本课题从msc治疗的角度出发,设计了kf处理msc“回输”以治疗皮肤创面的炎症的实践。证明了kf对msc的体外“改造”有助于msc治疗的潜力。然而,这一实践受制于动物模型和观察周期的限制,未能囊括“下调msc的fasl”进行回输的对照试验,以及未能应用慢性炎症或溃疡模型证实kf的性能。因此,还需要进一步完善。3.我们研究了hsfb在体外培养时受到kf作用而发生的表达变化。col-Ⅰ的下调和mmp的上调显示,kf作用下的hsfb降低了胶原的表达,提高的分解胶原酶的基质金属蛋白酶的表达,提示hsfb加快了胶原的代谢。这对于抑制以胶原为主要基质的瘢痕形成非常有利。我们初步证实了kf对hsfb细胞周期的影响和抑制增殖的机制是通过下调tgf-β通路蛋白smad2/3,而且kf能提高hsfb代谢胶原蛋白的效率,这提示了我们kf在动物模型中应用的潜力。因此,我们选用了药物溶液涂抹兔耳瘢痕模型来验证kf对hsfb增殖抑制的效果。结果显示,在涂抹kf后,瘢痕组织外观逐渐接近周围组织,在原本形成瘢痕的周期内,瘢痕组织明显变薄,sei显著低于涂抹dmso的对照组。对瘢痕组织中炎症因子的pcr检测表明,与瘢痕的消退的趋势一致,kf组瘢痕组织炎症状况也低于dmso组。但是,这种炎症降低是否也通过kf在创面作用于兔内源的msc而造成,有待进一步研究。【结论】本课题研究证实,黄酮类化合物山萘酚能以一定的浓度对在体外对培养的真皮中多能间充质干细胞和成纤维细胞产生重要作用。它能抑制成纤维细胞的增殖,改变其细胞周期分布,增加g1/g0期比重,并抑制成纤维细胞的迁移能力,但山萘酚却不抑制间充质干细胞增殖和迁移。在无创伤的小鼠体内,山萘酚能使到达局部真皮的外源和内源的bmmsc增加,参与真皮稳态维持。山萘酚同样参与创伤皮肤的稳态恢复,msc在这一过程中起到重要作用。我们发现,山萘酚在体外就可以增加连续培养传代的msc表面fasl的表达,在共培养体系中增加激活的t细胞的凋亡率。在动物创面模型上,kf也可以趋化更多的msc到达创面,其原因可能与受kf作用的真皮或表皮细胞分泌的趋化因子相关。受到kf作用的创面组织炎症水平明显下降,同时可以观察到创面组织fasl表达加强,提示在以往被报道的kf与免疫细胞的直接作用外,还存在kf对msc的作用调节免疫应答。基于此结论,我们向动物全层皮肤创面模型中局部移植了kf在体外处理的msc。结果显示,受到kf作用的msc相比对照组能更好的降低创面组织炎症,印证了kf可以通过加强msc免疫抑制能力调节组织稳态的结论。基于kf抑制成纤维细胞的结论,我们首先研究了kf抑制人源瘢痕成纤维细胞增殖并影响其细胞周期分布能力的机制,发现kf是通过降低磷酸化的smad2/3水平,干扰TGF-β通路实现对hsFb的抑制。随后在兔耳瘢痕模型上验证了Kf通过表面涂抹能产生抗瘢痕形成,降低瘢痕指数的治疗效果。同时Kf还可以降低瘢痕组织炎症水平,但这项功能是否也通过兔内源MSC发挥,则需进一步研究。