目的:设计一种准确、低成本新型FISH探针,通过这种新型FISH探针进行HER-2基因的FISH检测,对FISH探针有效性进行可行性分析,并对杂交体系进行优化。方法:培养HepG2细胞,提取总DNA,使用PCR技术与不对称PCR技术扩增得到HER-2基因片段的dsDNA及ssDNA目的序列,通过FISH检测对新型FISH探针中荧光标记序列进行特异性分析,并通过电泳法、Dot-blot法对新型FISH探针杂交效果进行可行性验证。采用寡核苷酸新型FISH探针,对细胞中RNA的分布进行定位;设计并通过PCR法制备长链新型FISH探针,对HER-2基因内含子进行定位,在抗原修复、酶消化时间及甲酰胺浓度等方面对FISH体系进行优化。结果:1、设计的新型FISH探针分为两部分,与荧光标记序列结合的序列区及与靶基因相结合的特异性序列区,实现FISH杂交过程中荧光标记序列的同时添加,不同靶基因只需更改与靶基因相结合的特异性序列区,实现同一条荧光标记序列可用于不同靶基因的检测,降低了探针成本。2、成功通过不对称PCR制备HER-2ssDNA片段,并验证新型FISH探针中荧光标记序列的特异性。3、成功使用新型FISH探针模拟寡核苷酸探针及长链DNA探针的杂交原理,并使用电泳法、Dot-blot法证明新型FISH探针可以与荧光标记序列、靶基因同时相结合,实现FISH检测。4、通过FISH检测成功对RNA进行定位,验证新型FISH探针可用于寡核苷酸探针;成功制备HER-2基因FISH探针,进行FISH检测,验证新型FISH探针可用于长链探针。5、标本预处理条件为胃蛋白酶消化时间7-15min,杂交液中甲酰胺浓度为在50%,荧光信号杂交率更高,背景更低,信噪比更高。结论:设计一种新型FISH探针结构,并验证其适用于寡核苷酸探针及长链DNA探针。采用新型FISH探针对RNA进行定位,并设计制备HER-2基因新型FISH探针,进行HER-2基因的检测,通过对杂交步骤中关键因素对杂交体系进行优化。本实验探针结构的改进,成功实现了同一条荧光标记序列对应不同的探针,通过孵育使得荧光、探针及靶基因同时杂交,可用于不同靶基因的检测,既节约了荧光标记的时间,也降低了探针成本。