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在奶牛群体改良体系中，种公牛的精液品质具有极其重要的作用，是影响奶牛群遗传品质的最主要因素。随着分子生物学技术的快速发展，候选基因法（Candidate GeneApproach）在动物遗传育种中起到重要的作用，人们可以在DNA水平上研究影响精液品质的候选基因或与其紧密连锁的分子标记，通过标记辅助选择（marker assisted selected，MAS）育种，为培育高产优质种公牛提供参考。精子在雌性生殖道内运动并最终与卵细胞结合完成受精，主要依靠精子鞭毛的摆动。精子鞭毛主要由鞭毛轴丝、外周致密纤维（ODFs）和线粒体鞘等组成。ODFs由围绕在鞭毛轴丝外侧的九个纤维组成，ODFs增加了精子尾部的抗张强度，改进了尾部的偏转角度矩即摆动力矩，可免除精子鞭毛在附睾运输和射精过程中受到的剪切损伤。免疫电镜镜检法证明TEKT4分布在精子鞭毛的ODFs的远轴凸面表面，推测Tektin4基因（简称TEKT4）可能与ODFs的稳定性和弹性有关。TEKT4是精细胞中含量丰富的蛋白，TEKT4的缺失导致精子鞭毛能量利用低效甚至无效，ATP消耗过多，前进的运动能力较弱，雄性生育能力显著降低，导致弱精子症。鉴于此，我们推测TEKT4与公牛不育有重要关联。本课题拟以TEKT4基因作为候选基因，筛选与精液品质相关联的分子标记，从基因转录、转录后调控、可变剪切模式等方面初步探究其影响公牛繁殖性能的分子调控机制。1.TEKT4基因SNP的扫描及其与公牛精液品质关联性分析采用DNA测序技术筛选中国荷斯坦公牛TEKT4基因的多态性位点，发现外显子2有一个SNP（g.+2346A>T），属于错义突变，突变引起了赖氨酸（Lys）转变成了甲硫氨酸（Met）；3’UTR区有一个SNP g.5858T>C。利用PCR-RFLP技术对SNP（g.+2346A>T）和SNP（g.+5858T>C）进行基因分型，并对其与精液品质性状进行关联性分析。结果发现，外显子2的SNP（g.+2346A>T），TT基因型的个体的鲜精活力、冻后活力和采精量显著高于AA型和AT型（P<0.05），畸形率显著低于AA型和AT型（P＜0.05）。3’UTR区的SNPg.+5858T>C，CC基因型个体的鲜精活力、冻后活力和鲜精密度显著高于TT和CT （P＜0.05），畸形率显著低于TT和CT （P＜0.05）。单倍体型组合H4H4和H1H4个体精液品质较高，可以作为分子标记辅助公牛选育。2. TEKT4基因3’UTR功能性SNP作用机制初步研究关联分析发现3’UTR区的g.5858T>C位点CC基因型为优良基因型。而3’UTR区发挥调控作用多数通过与miRNA结合来完成。为了进一步探索g.5858T>C对公牛繁殖性状的作用机制，我们进行了细胞水平转染实验来初步确定g.+5858T>C如何通过影响miRNA与靶位点结合从而影响牛精液品质。通过RNAHYBRID软件预测筛选出5个miRNA（bta-miR-196b、bta-miR-196a-1、bta-miR-196a-2、miR-27A和bta-let-7b）可以结合TEKT4基因3’UTR区，而SNP g.+5858T>C位于结合靶序列内。将野生型（TT）和突变型（CC）的3’UTR分别连接到PMIR-ReportTM Luciferase报告载体中，同时将5个miRNAs表达载体分别共转染MLTC-1细胞。通过双荧光素报告系统分析，发现3个miR都可以通过和TEKT4基因的3’UTR区结合降低报告基因的表达， bta-miR-196b（P<0.005）、bat-miR196A-1（P<0.01）和bta-let-7b（P<0.05）抑制效果显著。进一步的研究发现，这3个miRNA与野生型（TT）的结合能力比突变型（CC）的强，报告基因表达水平降低，即CC基因型个体由于突变与miRNA的结合能力减弱从而避免受睾丸中高表达的这几个miRNAs的负调控，使得TEKT4基因高表达。而TEKT4是精细胞中含量丰富的蛋白，TEKT4的缺失能导致精子鞭毛能量利用低效甚至无效，精子前进的运动能力较弱，雄性生育能力显著降低。因而我们推测g.+5858T>C突变影响了目标miRNA和靶序列的结合能力，导致CC个体TEKT4表达量较高，精液品质较高。结果显示：3’UTR的突变型（CC）可用于精液品质选择的功能性分子标记。3.TEKT4基因功能SNPs及可变剪切体的鉴定同一个Pre-mRNA经过不同的选择性剪切方式可以产生多种功能差异的蛋白质。利用RT-PCR技术发现了TEKT4基因除NCBI（登录序列号： NM001038069.2）公布的全转录本以外的7种新的可变剪切体。软件预测发现g.+3829T>C SNP （g.+2346A>T）突变后增加了一个剪切因子结合位点，可能参与缺失转录本2的剪切过程。4.TEKT4基因核心启动子的鉴定启动子是基因重要的组成部分，可以控制基因转录的起始时间和表达的程度。目前还没有关于奶牛TEKT4基因启动子区的相关报道。本课题利用生物信息学方法预测基因的核心启动子区，然后将不同长度的启动子预测区域片段构建入pGL3-Basic荧光素报告载体，瞬时转染小鼠睾丸间质瘤MLTC-1细胞。通过测定分析荧光素酶活性鉴定TEKT4基因核心启动子区为5’端侧翼区g.-376～g.+124区域。