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本研究以广西百色马中的德保矮马和土山马,以及新疆伊犁马作为实验动物。采用分段克隆技术,测定德保矮马线粒体基因组核苷酸全序列,并分析其基因的组成;利用PCR—RFLP技术和直接测序方法,研究百色马的遗传多样性,以及其母系起源和分化;克隆百色马的生长激素(GH)基因,分析其结构组成,并预测GH的二级结构;利用PCR—SSCP技术研究以上3种类型马的GH基因及其受体(GHR)基因的遗传多态性,运用一般线性模型(GLM)和方差分析,研究多态位点基因型对马体型性状的影响程度。结果如下:
1.德保矮马线粒体基因组核苷酸全序列的测定。结果表明:成功地从德保矮马的外周血液中纯化出了线粒体DNA(mtDNA);依此为模板,分段克隆出16段mtDNA片段,拼接后获得了德保矮马的mtDNA全序列,全长16654bp,GenBank登录号为EU939445;像其它哺乳动物的一样,德保矮马mtDNA富含碱基A、T,A+T占58.02%;它完整地包含13个蛋白质编码基因、2个核糖体RNA亚基、22个tRNA和一个控制区(D—Loop);蛋白质编码基因在密码子使用上具有一定的偏性:推测22个tRNA的二级结构呈典型的或近似的三叶草状;mtDNA D—Loop区包含2个扩展终止序列(ETAS1/2)、1个中央保守区(CD)、3个保守序列盒(CSB1/2/3)、1段重复序列(RS),RS由28个ACCTGTGC短片段串联形成。
2.利用PCR—RFLP技术和直接测序方法研究百色马mtDNA D—Loop区段的多态性,探讨百色马的遗传多样性和其母系起源、分化。结果表明:
(1)利用9种限制性内切酶对235匹德保矮马和75匹土山马的D—Loop全序列进行酶切多态性分析。结果发现,有5种内切酶表现出单酶切多态性;综合分析单酶切图谱,德保矮马D—Loop序列被分类为22个单倍型,GenBank登录号为FJ392562~FJ392580、GQ203125~GQ203127,土山马包含19个单倍型,GenBank登录号为GQ203128~GQ203144、GQ222059~GQ222060;德保矮马和土山马的单倍型多样度(h)分别为0.8604和0.9005,两者具有比较丰富的遗传多样性。
(2)PCR产物直接测序分析德保矮马、土山马和伊犁马的mtDNA D—Loop上游高变区序列(HVS)的多态性。结果发现,德保矮马和土山马均各表现出26个单倍型,伊犁马包含19种单倍型,单倍型多样度(h)分别为0.907、0.950和0.894,核苷酸多样度分别为1.651%、2.105%和1.999%;中性检验表明,德保矮马的分子进化偏离了中性模型,而土山马和伊犁马遵循中性模型;聚类分析发现,11个中国地方品种马156个单倍型主要集中于A、D、F、C等4个支系,A为主要支系;构建中国地方品种马的NJ、MP、ML等3种亲缘进化树,拓扑结构一致,支持家马的多母系起源学说。
(3)德保矮马和土山马的遗传距离值为0.024,两者的分化时间大约发生在29.63万年以前;结果分析认为,德保矮马和西南马的起源、进化线路重叠;人为的选种选配是造成德保矮马分子进化偏离中性模型的主要原因。
3.百色马GH基因的克隆及结构分析,并采用PCR—SSCP技术研究德保矮马、土山马和伊犁马等3种类型马GH基因的多态性,结果表明:
(1)成功克隆了德保矮马和土山马的GH基因的DNA序列,全长1922bp,包括完整的5个外显子和4个内含子,GenBank登录号分别为EU939446和FJ604598。德保矮马和土山马的GH基因序列同源性为99.6%,存在3个位点的碱基差异,其中前两个位点为无义突变,第1739位点的碱基差异引起GH第185位氨基酸的差异,即Arg(AGG)←→Gly(GGG)。基于GH基因构建不同种类动物的亲缘系统进化树,表明GH基因在物种进化中比较保守。蛋白质二级结构推测发现,百色马GH基因共编码216个氨基酸,其中前26个氨基酸为信号肽,后190个氨基酸为成熟肽;马的GH为全a型蛋白,包括4个螺旋,包含2个二硫键。
(2)利用PCR—SSCP技术对GH基因4个片段进行多态性分析发现:只有exon5片段表现出基因型多态性,即AA、BB和AB型,纯合子序列之间存在两个位点的碱基连锁差异;等位基因A和B的基因频率接近0.5,在这3种类型马群体中分布均匀,此多态位点属中度多态,处于非平衡状态。统计分析表明,GH基因exon5多态位点的基因型对3种类型马的体型性状指数的影响不显著(p>0.05)。
4.利用PCR.SSCP技术研究3种类型马GHR基因9个外显子序列的多态性,分析多态位点基因型对马体型性状的影响程度。结果表明:
(1)对GHR基因的9个外显子片段的PCR产物SSCP分析发现,exon1、exon3和exon5等3个片段表现出多态性,其它6个片段无多态性。在3种类型马群体中,exon1片段SSCP分析表现出3种基因型AA、GG和AG型,OG型为优势基因型,G为优势等位基因;exon3片段在德保矮马和土山马表现出4种基因型,即AA、AC、GA和GC,GA为优势基因型,A、G为优势等位基因,而伊犁马的exon3片段无多态性;exon5片段在3种类型马中表现出3种基因型,即AA、AG和GG型,GG为优势基因型,G为优势等位基因。exon1片段多态位点在德保矮马和伊犁马中为中度多态,而在土山马中为低度多态;exon3片段多态位点在德保矮马和土山马中为中度多态,而在伊犁马为单态;exon5片段多态位点在3种类型马中均表现为中度多态。Hardy—Weinberg平衡检验表明,在3种类型马群体中,exon1和exon3片段多态位点处于非平衡状态,exon5多态位点处于平衡状态。
(2)分析GHR基因3个多态位点基因型对马体型性状指数影响程度发现,exon1和exon5多态位点基因型对3种类型马的体型性状影响未达到显著水平(p>0.05);exon3多态位点基因型对德保矮马的体高和体长有显著性影响,AC基因型的平均体高和体长显著高于其它基因型(p<0.05),GC基因型的体型性状指数均低于其它基因型,拥有G等位基因的群体的平均体高、体长、胸围均比较小;二连组合效应分析发现,G3C3G5G5与矮马的体型矮小显著相关(p<0.05),相反,A3C3GsG5与矮马的体型高大密切相关(p<0.05)。三连组合效应分析发现,具有G1G1G3C3G5G5三连组合的德保矮马的体长、胸围均明显小于其它组合(p<0.05),且体高比较低。综合分析发现,GHR基因的3个多态位点之间不存在互作效应,exon3片段GC基因型是显著影响德保矮马体型性状的主要基因型,可以作为与矮马体型矮小性状密切相关的分子遗传标记。