论文部分内容阅读
人硫酸酯酶1(humansulfatase1，hSulf-1)是一个细胞生长的负向调控因子，在人体正常组织中恒定表达，而在绝大多数的肿瘤细胞系和肿瘤组织中（如乳腺癌、胰腺癌、肾脏癌、肝细胞癌等）表达水平下调。已有研究证明，肿瘤细胞中hSulf-1基因的再表达会导致细胞增殖、迁移、侵袭能力有所减弱，同时促进药物诱导的肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤发生和血管形成。hSulf-1基因编码一种芳基硫酸酯酶，在细胞外间质中降低硫酸肝素糖胺聚糖的硫酸化程度，进而影响与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)密切相关的多种胞外信号分子与其相应受体结合的过程，从而改变多种信号通路的活性。本研究旨在通过构建的腺病毒载体将目的基因hSulf-1运送到血管内皮细胞和肿瘤细胞中，在体内外研究hSulf-1蛋白对于细胞增殖与迁移能力的影响，为临床上肿瘤的基因治疗提供了新的分子靶标。
第一部分，hSulf-1基因腺病毒表达载体的构建
[目的]：克隆人硫酸酯酶1(hSulf-1)基因并构建稳定表达的腺病毒载体Ad5-hSulf1;
[方法]：采用PCR方法从pcDNA3.1-hSulf1质粒中扩增hSulf-1基因，插入到腺病毒质粒载体pDC315的多克隆位点区，构建pDC315-hSulf1。利用转染试剂，将pDC315-hSulf1与腺病毒包装质粒一起转入HEK293细胞中，得到重组腺病毒Ad5-hSulf1。PCR鉴定同时进行DNA测序，鉴定正确后，大量扩增并纯化。同样的方法构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的对照腺病毒Ad5-EGFP。TCID50法测定病毒滴度。
[结果]：PCR鉴定和测序结果都证实，hSulf-1基因腺病毒表达载体Ad5-hSulf1构建成功。TCID50法测病毒滴度，Ad5-hSulf1为1.15×1010pfu/mL(plaqueformingunit/mL)，对照病毒Ad5-EGFP滴度为1.80×108pfu/mL。
[结论]：成功构建了hSulf-1基因腺病毒表达载体Ad5-hSulf1，为进一步体内外研究奠定了基础。
第二部分，hSulf-1基因的过表达对血管内皮细胞增殖迁移能力的影响
[目的]：研究hSulf-1基因的过表达对于人脐静脉内皮细胞ECV-304增殖、迁移能力的影响。
[方法]：应用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1基因在ECV-304细胞中的表达及细胞内磷酸化Akt、ERK的表达变化;MTT实验检测hSulf-1过表达对于ECV-304细胞增殖的影响;采用划痕实验研究hSulf-1过表达对于ECV-304细胞迁移的影响。
[结果]：免疫印迹结果表明hSulf-1基因过表达会下调ECV-304细胞Akt和ERK信号分子的磷酸化水平;细胞增殖实验结果表明hSulf-1基因过表达抑制了ECV-304细胞增殖，感染复数为50，100时细胞存活率下降至(68.49±0.05)％以及（67.78±0.06）％;划痕实验结果表明hSulf-1基因过表达能够抑制细胞的迁移，实验组相比于对照组，细胞迁移能力明显减弱(P＜0.01)。
[结论]：重组腺病毒Ad5-hSulf1介导的hSulf-1基因在ECV-304细胞中的过表达明显抑制细胞增殖及迁移，为hSulf-1用于肿瘤及血管生长相关疾病的基因治疗奠定了基础。
第三部分，hSulf-1基因通过下调VEGFR2信号通路发挥抗肿瘤效应的体外实验研究
[目的]：通过体外实验研究hSulf-1基因如何通过影响VEGFR2信号通路发挥抗肿瘤效应。
[方法]：通过对不同肿瘤组织标本免疫组化检测hSulf-1基因的表达情况;Westernblotting检测肝癌、卵巢癌细胞中导入hSulf-1基因以及干扰hSulf-1基因后VEGFR2的表达变化;MTT实验分别检测hSulf-1基因的表达，VEGFR2的沉默以及两者联合对于肝癌、卵巢癌细胞增殖的影响。
[结果]：在肝癌，乳腺癌，胃癌，肾癌，和结肠癌样本的免疫组化结果显示hSulf-1基因的阳性表达率分别为23.1％、16.7％、31.8％、11.1％、44.4％，相比于hSulf-1阴性的肝癌，hSulf-1阳性的肝癌组织样本p-VEGFR2Tyr1175的表达水平明显下降(P＜0.05)，而t-VEGFR2的表达水平无明显区别(P＞0.05);Westernblotting结果显示肝癌、卵巢癌细胞中成功导入hSulf-1基因后p-VEGFR2Tyr1175的表达水平明显下降(P＜0.05)，干扰hSulf-1表达后p-VEGFR2Tyrl175的表达水平恢复到正常水平;MTT实验结果表明hSulf-1基因的表达，VEGFR2的沉默都会导致肝癌、卵巢癌细胞存活率下降，两者联合后肿瘤细胞存活率进一步降低。
[结论]：在大多数人类肿瘤中，hSulf-1基因失活是一个普遍的现象;在肝癌和卵巢癌细胞中，hSulf-1基因的表达会下凋p_VEGFR2Tyr1175的表达水平，肿瘤细胞增殖能力减弱。
第四部分，裸鼠肿瘤模型的建立及研究hSulf-1基因的表达对瘤内血管密度和肿瘤生长的影响
[目的]：建立小鼠肿瘤模型，通过体内实验研究hSulf-1基因的表达对于小鼠肿瘤生长以及瘤内血管生长的影响。
[方法]：建立小鼠肝癌、卵巢癌移植瘤模型，给予hSulf-1基因治疗，观察移植瘤的生长情况，免疫组化及Westernblotting验证hSulf-1对移植瘤血管密度及信号通路的影响;
[结果]：成功建立小鼠肝癌、卵巢癌移植瘤模型，两个模型中都表现为Ad5-hSulf1组肿瘤生长抑制最为明显，与空白对照组相比，卵巢癌模型组抑制率为46.19％，肝癌模型组抑制率为49.56％(P＜0.01);而阴性对照组与空白对照组之间无明显差别(P＞0.05)。剥离卵巢癌移植瘤瘤体，Ad5-hSulf1组瘤体的质量相比于另外两组明显小(P＜0.01);CD31免疫组化结果显示，Ad5-hSulf1组和对照组的血管密度分别为24.67±6.51和2.33±12.34，二者差异明显(P＜0.05);Westernblot和免疫组化结果显示，与对照组相比，Ad5-hSulf1组中p-VEGFR2Tyr1175和p-AKTThr308表达均下调。
[结论]：以裸鼠为实验动物分别建立卵巢癌SKOV3细胞成瘤模型和肝癌BEL-7404细胞成瘤模型。用腺病毒Ad5-hSulf1对其进行治疗，同时设置对照组。结果显示Ad5-hSulf1治疗后肿瘤生长受阻，p-VEGFR2Tyr1175和p-AKTThr308水平下调，明显抑制肿瘤血管密度。